Новое исследование, проведенное учеными из Медицинского центра Университета Вандербильта и Медицинской школы Перельмана Университета Пенсильвании, опубликованное на сервере препринтов bioRxiv * в августе 2020 года, сообщает, что оба ключевых фермента, необходимые при тяжелых В бета-клетках панкреатического островка отсутствует проникновение коронавируса 2 острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) в человеческую клетку-хозяин. Это исключает гипотезу о прямом повреждении для нарушения контроля глюкозы у пациентов с COVID-19.

COVID-19 и диабет

В условиях продолжающейся пандемии COVID-19 однозначно установлено, что диабет является фактором риска смертности и тяжелых заболеваний. Более того, было идентифицировано несколько новых групп впервые возникшего диабета, а также ухудшение диабетических состояний из-за возникновения диабетического кетоацидоза и гиперосмолярной гипергликемии.

Это привело к предположению, что SARS-CoV-2 является диабетогенным вирусом, вызывая токсичность для бета-клеток островков поджелудочной железы, секретирующих инсулин. Исследования in vitro демонстрируют, что проникновение вируса в человеческую клетку-хозяин зависит от взаимодействия вирусного шипового белка с ангиотензин-превращающим ферментом (АПФ) 2 в клетке. За этим следует протеолитическое расщепление белка-шипа сериновой протеазой TMPRSS2.

SARS-CoV вызывает острый диабет?

Более ранний патогенный коронавирус SARS-CoV, который вызвал более ограниченную вспышку в период с 2002 по 2004 год, также использует рецептор ACE2. Предыдущие исследования образцов аутопсии пациентов, умерших от этой инфекции, показали, что ACE2 был обнаружен на клетках островков поджелудочной железы от одного донора (хотя тип клетки не был ясен). Таким образом, они впервые высказали идею, что взаимодействие вируса с ACE2 вызывает повреждение островков и вызывает острый диабет. Это было обратимо, как только инфекция исчезла.

Экспрессируют ли бета-клетки ACE2?

Те же авторы недавно сообщили, что они индуцировали бета-подобные клетки из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC). Было обнаружено, что тесты на этих клетках, а также на бета-клетках островков поджелудочной железы человека, выделенных из этого органа, экспрессируют ACE2, что подтверждает их гипотезу о прямом вирусном поражении этих клеток.

Поиск экспрессии ACE2 / TMPRSS2 в бета-клетках

Настоящее исследование направлено на проведение более глубокого анализа клеток поджелудочной железы на экспрессию ACE2 и TMPRSS2 у лиц с диабетом и без него. Исследователи не обнаружили никаких доказательств этого в эндокринных клетках островков человека у диабетических или недиабетических доноров. Это означает, что они говорят, что прямое воздействие вируса на индукцию диабета маловероятно.

Фактически, экспрессия мРНК, транскрибирующей либо ACE2, либо TMPRSS2, минимальна в альфа- и бета-клетках человека.

При секвенировании РНК не удается найти ACE2 / TMPRSS2

Исследователи сначала использовали данные из двух наборов данных массового секвенирования РНК (RNA-seq), сравнивая экспрессию мРНК этих двух ферментов в альфа- и бета-клетках ткани островков поджелудочной железы человека с экспрессией важных генов, кодирующих, например, транскрипцию. факторы в островковых клетках. Эти гены обычно экспрессируются в этих клетках на низких уровнях.

Однако средний уровень экспрессии мРНК ACE2 и TMPRSS2 был значительно ниже, чем мРНК для этих обогащенных островками генов. То есть эти две мРНК присутствовали на 84% и 92% более низких уровнях экспрессии по сравнению с уровнями экспрессии некоторых ДНК-связывающих факторов транскрипции в альфа- и бета-островковых клетках.

Они также обнаружили, что анализ одноклеточной (sc) РНК-seq островков поджелудочной железы человека продемонстрировал отсутствие или минимальную экспрессию мРНК, транскрибирующих гены ACE2 и TMPRSS2. Они использовали результаты, полученные из более чем 25000 клеток из базы данных Программы анализа поджелудочной железы человека (HPAP), предоставленные 11 здоровыми донорами, а также три небольших набора данных. Тем не менее, они обнаружили экспрессию ACE2 / TMPRSS2 менее чем в 1% бета-клеток по всем наборам данных.

Низкая коэкспрессия ACE2 / TMPRSS2 в не островковых клетках

Экзокринные клетки показали положительную реакцию на ACE2 от умеренных до высоких уровней для 5% эндотелиальных клеток и перицитов в наборе данных HPAP, но только до 3% в трех других. Это различие несущественно и, скорее всего, связано с разным количеством ячеек в каждом анализе, в 20 раз больше в базе данных HPAP по сравнению с наименьшим набором. Объединенный анализ показывает, что в целом менее 1% ацинарных или протоковых клеток имели экспрессию ACE2, но 35% обоих типов клеток экспрессировали TMPRSS2. Напротив, в самом маленьком исследовании экспрессия ACE2 и TMPRSS2 в этих клетках была на уровне 20% и более 75% соответственно.

Поскольку это ключевые ферменты для заражения SARS-CoV-2, исследователи обнаружили, что оба они экспрессируются вместе менее чем в 1% из четырех типов клеток (ацинарных, протоковых, эндотелиальных и звездчатых) в трех наборах данных. В четвертом, процент коэкспрессии составил 5% и 15% для ацинарных и протоковых клеток соответственно.

Исследователи отмечают: « Примечательно, что ни в одном из этих четырех наборов данных нет островковых эндокринных клеток, коэкспрессирующих ACE2 и TMPRSS2».

Прямая визуализация не может обнаружить ACE2

Во-вторых, исследователи перешли от транскриптомики к прямой визуализации. Они использовали иммуноокрашивание криосрезов островков с тем же антителом ACE2, о котором сообщили ранее исследователи. Однако они не смогли обнаружить ACE2 на бета-клетках, а только на микрососуде.

Исследователи отмечают, что разница, возможно, связана с использованием бета-клеток, полученных из стволовых клеток, которые считаются ювенильными, а не функционально зрелыми, или иммортализованными бета-клетками в культуре в более раннем учиться. Чтобы исключить эту возможность, они затем повторили процесс, используя срезы ткани поджелудочной железы, полученные от детей в возрасте 5 лет или младше (одному было всего 5 дней). Однако они все еще не нашли ACE2.

ACE2, локализованный в микроциркуляторном русле

Затем исследователи изучили донорскую ткань поджелудочной железы от диабетических и недиабетических доноров. Доноры-диабетики страдали диабетом 1 или 2 типа. И здесь ACE2 не был обнаружен ни в альфа, ни в бета-клетках, а был обнаружен в микрососудистых структурах как у здоровых доноров, так и у пациентов с диабетом 2 типа.

Они повторили свой анализ с тремя другими антителами к ACE2, используемыми несколькими другими исследователями, но не смогли найти этот белок на островковых клетках.

TMPRSS2, локализованный в воздуховодах

Они также не обнаружили TMPRSS2 в островках у здоровых доноров или доноров с диабетом 1 типа, но он был локализован на экзокринной ткани, на эпителии протоков. В целом они пришли к выводу, что эти белки не обнаруживаются на островковых эндокринных клетках здоровых или диабетических доноров. Ученые теперь думают, что более ранние результаты могут быть связаны с ключевыми различиями в способах проведения эксперимента и, возможно, с артефактами.

DPP4, обнаруженный на альфа-клетках

Опять же, после более недавнего исследования in silico, которое показало возможность связывания вируса с дипептидилпептидазой 4 (DPP4) человека для обеспечения проникновения вируса, они искали этот белок на поджелудочной железе человека. Они обнаружили, что он был локализован в альфа, но не в бета-клетках всех доноров, диабетиков или нет.

Это открытие согласуется с транскриптомным анализом, основанным на всех четырех наборах данных, который также продемонстрировал, что эти клетки были обогащены DPP4. Однако, по их словам, отсутствие TMPRSS2 указывает на то, что DPP4, вероятно, не связан с проникновением вирусных клеток в бета-клетки.

ACE2 локализован в капиллярах островков и экзокринной ткани

Затем исследователи изучили характер окрашивания ACE2 в неэндокринных клетках поджелудочной железы, в частности, чтобы выяснить, локализуется ли он в микроциркуляторном русле. Они пришли к выводу, что это так, периваскулярные капилляры островков, а также экзокринная ткань демонстрируют экспрессию ACE2.

Они предполагают, что этот белок экспрессируется на перицитах, клетках, которые покрывают эндотелиальные клетки капилляров. Однако, поскольку TMPRSS2 отсутствует, эта ячейка не будет нацелена на SARS-CoV-2. И на самом деле, хотя оба эти белка обнаруживаются на эпителии протоков, они не встречаются вместе.

TMPRSS2 находится на апикальной поверхности клеток протоков экзокринной части поджелудочной железы, но не ACE2. В тех немногих случаях, когда они оба встречаются вместе, они локализуются отдельно. Исследователи говорят, что они могут представлять собой возможную вирусную мишень.

При диабете 1 типа экспрессия ACE2 низкая по сравнению со здоровыми донорами.

Последствия

Большинство исследователей согласны с тем, что ACE2 и TMPRSS2, вероятно, являются клеточными механизмами, необходимыми для проникновения вируса в клетки-хозяева, хотя теоретически возможны и другие пути. В этом сценарии текущие результаты не показывают разрешающую роль бета-клеток поджелудочной железы.

Некоторые ограничения текущего исследования включают тот факт, что исследователи полагались на демонстрацию этих белков, а не на изучение связывания вируса или проникновения в бета-клетки. Наконец, они не измеряли экспрессию этих белков у пациентов с диабетом и COVID-19, поэтому они не могут исключить изменения этих рецепторов у таких пациентов.

Исследование подводит итог: «В целом эти результаты значительно снижают вероятность того, что SARS-CoV2 может связываться и проникать в человеческие В-клетки и иметь прямую цитотоксичность». Вместо этого они предпочитают объяснение, что на гомеостаз глюкозы, вероятно, влияет воспаление или повреждение печени, мышц или жировых клеток, что необходимо подтвердить в ходе дальнейших исследований.

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.

Источник