Даже несмотря на то, что COVID-19 продолжает свой неумолимый путь, унося сотни тысяч жизней и вызывая почти 11 миллионов случаев, диагноз инфекции все еще недостаточно чувствителен или специфичен. Теперь новое исследование, проведенное учеными из Института Фрэнсиса Крика и опубликованное на сервере препринтов medRxiv * в июне 2020 года, описывает стандартную операционную процедуру (SOP), позволяющую быстро и с высокой пропускной способностью обнаруживать тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) с помощью анализа RT-LAMP. Это позволило бы создать надежный, воспроизводимый и экономически эффективный метод обнаружения.

Причина текущего исследования

Данное исследование было мотивировано опытом исследователей из их биомедицинского научно-исследовательского института, в начале пиковой фазы пандемии. Они создали рабочий процесс диагностического тестирования в сотрудничестве с филиалами больниц и аккредитованной диагностической лабораторией для расширения возможностей тестирования, особенно для работников здравоохранения.

Сначала они использовали набор буферов для вирусной инактивации с последующим извлечением РНК и системой отчетности на основе Интернета. Несмотря на сообщение о результатах тестирования на обнаружение вирусов на более чем 40 000 образцах ОТ-ПЦР, с начала апреля 2020 года они поняли, что не в состоянии удовлетворить спрос, и использовали слишком много ресурсов.

«Поскольку сняты ограничения на блокировку, тестирование людей на наличие этого коронавируса и, при необходимости, их инструктаж и их тесный контакт с самоизолирующим средством абсолютно необходимы. Без эффективного тестирования вирус может быстро распространиться по сообществам, вызывая еще больше смертей », – говорит автор исследования Caetano Reis e Sousa.

Исследование: RT-LAMP для обнаружения SARS-CoV-2

Данное исследование является плодом их второй цели – опубликовать проверенные альтернативные стратегии, которые позволят большую независимость ОТ-ПЦР, увеличат возможности тестирования и, возможно, позволят проводить диагностику на месте оказания медицинской помощи. Исследователи использовали петлю-опосредованную изотермическую амплификационную ПЦР наряду с обратной транскрипцией, называемой RT-PCR, для обнаружения SARS-CoV-2. Вся процедура завершается в течение 30 минут и не требует использования термоциклера КПЦР.

Эта методика уже была разработана для РНК-вирусов и других микробов и даже для SARS-CoV-2. Текущее исследование использовало метод, чтобы позволить или визуальную или опосредованную ДНК-красителем количественную оценку. Они использовали уже разработанные праймеры для нацеливания на ген N вируса вместе с праймерами, которые обнаруживают 18S РНК для параллельного контроля качества.

Преимущества RT-LAMP

Результаты показывают, что RT-LAMP полностью пригоден для использования вместо RT-qPCR в качестве средства обнаружения SARS-CoV-2. Этот метод не только предотвращает неспецифическую и перекрестно-реактивную амплификацию других человеческих CoVs или респираторных вирусов, но и является почти таким же чувствительным, как RT-qPCR.

Общая стоимость реагента уменьшается в десять раз. Это также намного быстрее, выдача результатов за 25 минут, а это означает, что результат может быть увеличен в четыре раза. Это помогло бы определить, должен ли кто-либо из тестируемых лиц самоизолироваться и резко снизить риск распространения вируса.

Избегание стадии экстракции РНК

Ранние данные текущего исследования также указывают на то, что этап извлечения РНК не потребуется, что дополнительно снижает стоимость и позволяет получить более быстрые результаты, даже тестирование в месте оказания медицинской помощи. Весь метод был также одобрен государственными органами здравоохранения и аккредитован в соответствии с действующими стандартами, что позволяет немедленное развертывание.

Тест был подтвержден на 24 образцах пациентов. Все 12 положительных образцов были признаны положительными, и все 12 отрицательных образцов не демонстрировали усиления, что соответствовало во всех случаях текущей диагностической платформе.

Надежные и конкретные результаты

Порог обнаружения был установлен, основываясь на предыдущих данных, чтобы обеспечить максимальное время работы 25 минут для гена N и 20 минут для 18S рРНК. По этим критериям в анализе на SARS-CoV-2 не было ложных срабатываний. Использование обычной кривой плавления позволило исключить ложные срабатывания и повысить достоверность результатов.

Специфичность анализа оценивали с использованием клинических образцов от пациентов без COVID-19, но с несколькими другими сезонными коронавирусами, вирусами гриппа A и B и другими вирусами РНК. Ни один из образцов не был положительным с анализом RT-LAMP для гена N, демонстрируя его высокую специфичность.

RT-LAMP имеет сопоставимую чувствительность с ПЦР

Для оценки чувствительности использовался образец, представляющий собой стандартный образец, оцениваемый по ограничению разбавления для определения предела достоверного обнаружения. Было установлено, что предел обнаружения (LOD) составляет 500-1000 копий N-гена. Воспроизводимость и точность метода были обнаружены путем пятикратного выделения и анализа РНК из положительного образца, а затем с помощью теста на ген N и 18S рРНК.

Затем анализ сравнивали со стандартными методами RT-КПЦР на 37 образцах. Результаты показали 100% согласие на обнаружение позитивов, но когда время цикла для позитивов было близко к LOD, пограничные позитивы не могли быть надежно обнаружены с помощью анализа N-гена, но были обнаружены с помощью анализа 18S рРНК.

Повторные эксперименты показали, что RT-LAMP не всегда идентифицировал вирусную РНК в образцах, выполненных в двух экземплярах, когда время цикла находилось в пределах 2 циклов LOD анализов ОТ-ПЦР. Это указывает на немного более низкую чувствительность RT-LAMP по сравнению с ПЦР на экстрагированной РНК. Тем не менее, первый был запущен только с одной трети входной РНК, используемой для ПЦР. Во-вторых, некоторые недавние исследования показывают, что добавление гуанидина может улучшить чувствительность определения с помощью RT-LAMP.

Последствия

Наконец, использование RT-LAMP без предварительной экстракции РНК показало 94% -ное согласие с результатами ОТ-ПЦР, что показывает, что этот этап может быть потенциально опущен. Тем не менее, исследователи предупреждают, что этот вывод требует проверки с фактическими клиническими образцами.

Если также в сочетании с колориметрическим считыванием с машины для составления отчетов на основе красителя, результирующее сокращение затрат и времени может привести к очень конкурентоспособному и недорогому диагностическому рабочему процессу, способному к применению в местах оказания медицинской помощи и его использовании в удаленных и бедных странах. области.

Соавтор Майкл Бак говорит: «Мы надеемся, что это может помочь новым или существующим предприятиям расширить и повысить эффективность их испытаний».

* Важное замечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как убедительные, направлять клиническую практику / поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.