Ученые разработали метод повышения эффективности редактирования гена CRISPR при мышечной дистрофии Дюшенна (МДД), согласно исследованию, которое может иметь значение для оптимизации генной терапии для других заболеваний.

Открытие было получено в результате исследований, проведенных в UT Southwestern, в которых на мышах и клетках человека использовалась методика однократного редактирования генов для коррекции распространенной мутации, лежащей в основе DMD, смертельного заболевания, вызванного потерей дистрофина, белка, критического для мышечная функция.

При тестировании этой технологии ученые обнаружили, что корректировка дозировок компонентов редактирования генов CRISPR может значительно улучшить количество дистрофина, продуцируемого отредактированными генами. Они также обнаружили, что оптимальное соотношение компонентов изменялось в зависимости от того, какая часть ДНК редактировалась.

«Когда мы тестируем CRISPR на других дефектных участках гена дистрофина, может быть важно изменить наши формулы для достижения оптимальных результатов», – сказал д-р Эрик Олсон, возглавлявший исследование, опубликованное в Science Advances , «Это новое понимание еще больше облегчает использование CRISPR в качестве терапии Дюшенна и, возможно, ряда других заболеваний».

Неожиданное обнаружение

Техника редактирования генов, используемая исследователями, требует двух компонентов – фермента Cas9, который разрезает ДНК, и направляющей РНК, которая функционирует как молекулярное устройство GPS, чтобы направлять Cas9 к определенной последовательности ДНК в геноме, подлежащем редактированию.

Д-р. Лаборатория Олсона разработала метод редактирования дефектной части гена дистрофина путем загрузки Cas9 в аденоассоциированный вирус (AAV), безвредный вирус, который используется для доставки компонентов редактирования в клетки. Направляющая РНК также загружается в AAV для направления Cas9 в мутацию, где она отсекает ДНК.

Процесс редактирования обходит мутацию и позволяет мышечным волокнам вырабатывать дистрофин, при этом положительные результаты, документированные в предыдущих исследованиях доктором Олсоном на крупных млекопитающих, мышах и клетках человека.

В этих исследованиях команда использовала стандартное соотношение Cas9 и направляющей РНК 1: 1, чтобы помочь восстановить выработку дистрофина в мышцах до более чем 90 процентов от нормы.

В новом исследовании, нацеленном на другую часть гена, они обнаружили, что соотношение 1: 1 также не работает: выработка дистрофина восстанавливается только до 5 процентов от нормы при доставке в кровоток.

Методом проб и ошибок ученые обнаружили, что использование отношения 10: 1 к направляющей РНК и Cas9 позволило оптимально редактировать этот конкретный сегмент гена дистрофина. В течение четырех недель после приема дозы CRISPR выработка дистрофина была восстановлена ​​примерно у 90 процентов мышечных и сердечных волокон у мышей с общей мутацией DMD.

«Это удивительно», – сказал доктор Йи-Ли Мин, первый автор исследования. «Мы всегда поставляли направляющие РНК и Cas9, используя два вируса в равных количествах, и не думали о том, чтобы изменить соотношение».

Дефектные экзоны

МДД, наиболее распространенное смертельное генетическое заболевание у мальчиков, приводит к мышечной и сердечной недостаточности и преждевременной смерти к началу 30-х годов. Пациенты вынуждены садиться в инвалидные коляски, когда их мышцы дегенерируют, и, в конечном итоге, на респираторы, поскольку их мышцы диафрагмы ослабевают. Эффективного лечения не существует, хотя в течение десятилетий ученые знали, что дефект в любом из 79 экзонов, которые содержат длинный ген дистрофина, вызывает это состояние.

Д-р. Олсон опубликовал множество исследований, в которых его лаборатория делала отдельные разрезы в стратегических точках ДНК, чтобы исправить мутации. В том числе в своем последнем исследовании, посвященном удалению экзона 44, в его лаборатории были созданы методы CRISPR, нацеленные на пять наиболее распространенных дефектов, наблюдаемых у пациентов с МДД, что составляет около половины случаев во всем мире. Клиническое лечение экзона 44, расположенного в одной из наиболее распространенных мутационных горячих точек гена, может помочь примерно 12 процентам пациентов.

Методы еще не были одобрены для клинического использования, но команда доктора Олсона сделала большой шаг к этой цели в прошлом году после публикации научного исследования, показывающего, что изменения CRISPR на экзоне 51 остановили прогрессирование МДД у собак.

В течение нескольких недель после редактирования гена отсутствующий белок был восстановлен в мышечной ткани по всему телу, включая 92-процентную коррекцию в сердце и 58 процентов в диафрагме, основной мышце, необходимой для дыхания. Ученые подсчитали, что для существенной помощи пациентам необходим 15-процентный порог.

Лаборатория проводит долгосрочные исследования на собаках, чтобы измерить, остаются ли уровни дистрофина стабильными и гарантировать, что изменения гена не имеют неблагоприятных побочных эффектов.

Д-р. Олсон надеется, что следующим шагом за собаками станет клиническое испытание, которое станет одним из нескольких, которые программа генной терапии UT Southwestern намеревается запустить в ближайшие годы для лечения многочисленных смертельных детских болезней.

«Нам нужно еще многое сделать, прежде чем мы сможем использовать это клинически, – сказал доктор Олсон, – но интересно видеть, как далеко мы продвинулись».