Новая техника значительно улучшает разрешение светового микроскопа

Физические условия, как правило, ограничивают резкость светового микроскопа, например, структуры, расположенные ближе, чем на 0,2 тысячных миллиметра, будут размываться друг от друга и больше не будут отличаться друг от друга.

Дифракция ответственна за это размывание: проще говоря, дифракция гарантирует, что световые лучи не могут быть связаны со случайной точностью. Следовательно, каждый объект в форме точки отображается как «размытое пятно», а не как точка.

С помощью математических методов все еще возможно радикально улучшить разрешение. Хотя можно вычислить его точный центр по распределению яркости «размытого пятна», он работает только тогда, когда две близко расположенные точки объекта изначально не параллельны, но впоследствии очевидны, а затем объединяются при обработке изображения. Наложение «размытого пятна» предотвращается этой временной развязкой. В течение нескольких лет ученые в области наук о жизни применяли эту хитрую технику для световой микроскопии клеток сверхвысокого разрешения.

Исследовательская группа профессора доктора Маркуса Зауэра из Университета Вюрцбурга разработала один тип этого метода – прямую стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию, или dSTORM. Этот надежный метод SMLM способен обеспечить боковое разрешение около 20 нм. По этой причине конкретные структуры, например, поры клеточного ядра, окрашиваются с использованием флуоресцентных красителей. Каждая молекула красителя мигает через случайные интервалы и обозначает часть поры. В результате изображение всей ядерной поры сначала не видно, но становится видимым после обработки изображения путем наложения нескольких тысяч изображений.

С помощью метода dSTORM разрешение традиционного светового микроскопа можно увеличить в 10 раз. « Это позволяет, например, визуализировать архитектуру клетки вплоть до ее молекулярного уровня », – объяснила исследователь Ханна Хейл. Она делает докторскую степень в Центре Рудольфа Вирхова в Вюрцбургском университете в группе профессора Катрин Хайнце.

И наоборот, предел виртуального разрешения в разрешении определяется самой статистикой фотонов. Чтобы решить эту проблему, Катрин Хайнце предложила применить сравнительно простые биосовместимые нанопокрытия для улучшения сигнала. Совместными усилиями с Маркусом Зауэром и сотрудниками физического факультета Ханна Хейл спроектировала и разработала металлодиэлектрические нанопокрытия, которые действуют подобно перестраиваемому зеркалу. Они почти увеличивают разрешение в два раза.

Зеркало, зеркало на стене: какое изображение самое острое из них?

Затем исследователи осаждали покровное стекло, на котором клетки были расположены во время наблюдения, с тонким отражающим нанопокрытием, состоящим из прозрачного нитрита кремния и серебра. Поскольку покрытие является биосовместимым, оно сохраняет целостность клетки. Благодаря этой методике обе группы смогли достичь двух эффектов: зеркало отражало свет, излучаемый микроскопом, что увеличивало яркость флуоресцентного сигнала и, таким образом, эффективно увеличивало резкость изображения.

Второе явление также существует: отраженные и испускаемые световые волны накладываются, создавая так называемые помехи. В зависимости от расстояния до зеркала свет ослабляется или усиливается. « Таким образом, мы в первую очередь видим структуры в определенной плоскости изображения », – заявил Хейль.

« С другой стороны, все, что находится выше или ниже и может нарушить изображение, скрыто ». Чтобы убедиться, что фактические части изображения становятся заметными, важно правильно выберите толщину прозрачного слоя, нанесенного на зеркало. Среди прочего, Хайль и Хайнце применяют компьютерное моделирование для настройки покрытия в соответствии с объектом.

В целом, метод оказался неожиданно простым в использовании, заявила Ханна Хейл. « Вот что мне действительно нравится в нашем подходе ».

За исключением дешевого покровного стекла с металлическим диэлектрическим покрытием, нет необходимости в каком-либо дополнительном оборудовании или программном обеспечении для микроскопа, чтобы повысить точность локализации, и, таким образом, это фантастическое дополнение в усовершенствованной микроскопии .

Д-р Катрин Хайнце, профессор, Центр экспериментальной биомедицины им. Рудольфа Вирхова, Вюрцбургский университет.

Source link