Новый подход к микроскопии позволяет получать наноразмерные изображения головного мозга мышей и мух

Эрик Бетциг не ожидал, что эксперимент сработает. Недавно два исследователя, Шох Асано и Руйсюань Гао, пытались использовать микроскоп своей команды на образцах мозга, которые были увеличены в четыре раза по сравнению с их обычным размером – надутыми, как воздушные шарики.

Лес дендритных шипов выступает из ветвей нейронов в коре мыши. (Изображение предоставлено: Gao et al. / Science 2019)

Дуэт, являющийся частью лаборатории Эда Бойдена в Массачусетском технологическом институте (MIT), использует химический метод для увеличения крошечных образцов, чтобы исследователям было легче просматривать молекулярные детали.

Хотя их метод, известный как экспансионная микроскопия, по-видимому, хорошо работал на тонких срезах ткани или единичных клетках, полученных в традиционных световых микроскопах, группа Бойдена стремилась получить изображения гораздо больших участков ткани. Они хотели визуализировать все нейронные схемы, которые охватывают миллиметры или больше. Исследователи нуждались в микроскопе, который имел превосходное разрешение и скорость, а также был сравнительно мягким – что-то, что не повреждает образец, прежде чем они смогут завершить процесс формирования изображения.

Таким образом, они искали Бетцига, чья исследовательская группа в исследовательском кампусе Медицинского института им. Говарда Хьюза в Янелии использовала решетчатый микроскоп с тонкими листами для получения трехмерного изображения быстрой внутриклеточной динамики деликатных живых клеток. Объединение двух методов микроскопии может обеспечить быстрое и полное изображение широких участков мозговой ткани.

« Я думал, что они были полны им », вспомнил Бетциг. « Идея звучит немного грубо », – заявил Гао. « Мы растягиваем ткани друг от друга ». Однако Бетциг пригласил Асано и Гао опробовать решетку.

« Я собирался показать им », – рассмеялся Бетциг, но вместо этого он был поражен. « Я не мог поверить в качество данных, которые я видел. Вы могли бы опрокинуть меня пером . »

В настоящее время Бетциг и его коллеги по Джанелии установили партнерские отношения с командой Бойдена и изобразили участки мозга мыши, весь мозг плодовой мухи и толщину коры головного мозга. Интегрированная методика исследователей не только быстра, но и обеспечивает высокое разрешение с возможностью визуализации любого необходимого белка.

Чтобы изобразить мозг мухи в различных цветах, потребовалось всего 62,5 часа, в отличие от тех лет, которые обычно потребовались бы при использовании электронного микроскопа, сообщают Бетциг, Бойден и их коллеги из Science . ] журнал от 17 января th 2018.

« Я вижу, как мы можем получать изображения, по меньшей мере, 10 мозгов мухи в день », – заявил Бетциг, который в настоящее время является исследователем HHMI в Калифорнийском университете в Беркли. Он добавил, что такое разрешение и скорость позволят исследователям задавать новые вопросы, например, как различаются мозги у самок и самцов или как различаются мозговые контуры между одними и теми же типами мух.

Команда Бойдена мечтает создать очень полную карту мозга, которая позволит ученым моделировать ее на компьютере. « Мы переступили порог производительности изображения », – заявил Бойден, который был выбран в качестве исследователя HHMI в 2018 году. « Вот почему мы так взволнованы. Мы не просто сканируем больше мозговой ткани, мы сканируем весь мозг ».

Расширение мозга

Однако, чтобы создать всесторонние карты мозга, необходимо составить схему его проводки и активности – неисчислимое количество соединений, установленных каждым из более чем 80 миллиардов нейронов в человеке. Такие карты могут помочь исследователям определить, где именно начинается заболевание головного мозга, или создать более совершенный искусственный интеллект, или даже описать поведение. « Это как святой Грааль для неврологии », – заявил Бойден.

Несколько десятилетий назад у его команды была идея выяснить, как все устроено: что, если мозг можно сделать больше – достаточно большим, чтобы заглянуть внутрь? Команда наполнила образцы набухающими гелями – аналогично материалам в детских подгузниках – и в конечном итоге обнаружила метод расширения тканей, позволяющий сделать внутренние молекулы менее тесными и их легче просматривать под микроскопом. Эти молекулы фиксируются в гелевом каркасе и сохраняют одинаковые относительные положения даже после расширения.

Тем не менее, было трудно изобразить объемные ткани. Если образец становится толще, становится труднее освещать только зелья, которые необходимо визуализировать. Если избыточный свет будет освещаться на образцах, он будет фотообесцвечивать их, сжигая флуоресцентные «лампы», используемые исследователями для освещения клеток.

Если образец будет расширен в четыре раза, он увеличит свой объем в 64 раза, следовательно, скорость визуализации также становится критической, заявил Гао. « Нам нужно было что-то быстрое и без особого фотообесцвечивания, и мы знали, что в Джанелии был фантастический микроскоп », – добавил Гао.

Усовершенствованный решетчатый микроскоп с тонкими листами сканирует ультратонкий слой света через образец, освещая только ту часть в плоскости фокуса микроскопа. Это помогает сфокусированным областям оставаться темными, сохраняя флуоресценцию образца от гашения.

Когда Асано и Гао первоначально проверили свои расширенные ткани мыши на микроскопе с тонкими световыми решетками, они обнаружили заросли светящихся шипов, торчащие из ветвей нейронов. Названные дендритными шипами, кусочки обычно напоминают грибы с выпуклыми головками на узких шейках, которые трудно определить. Тем не менее, Асано сообщил, что исследователи смогли увидеть даже «наименьшую возможную шею», и в то же время одновременно визуализировали смежные синаптические белки.

« Это было невероятно впечатляюще », – заявил Бетциг. Группа была убеждена, что им следует дополнительно изучить комбинированный метод. « И это то, чем мы занимаемся с », – заявил он.

Мозг и не только

В последние пару лет Асано и Гао провели несколько месяцев в Джанелии, сотрудничая с физиками, компьютерными учеными-микроскопистами и биологами по всему университетскому городку, чтобы захватывать и изучать изображения. « Это похоже на сотрудничество на уровне Мстителей », – заявил Гао, имея в виду группу супергероев из комиксов.

Высококачественные образцы мозга мухи, предоставленные Yoshinori Aso и командой FlyLight, были расширены и использованы Асано и Гао для получения около 50 000 кубов данных по отдельным мозгам – создавая своего рода трехмерную головоломку. Эти изображения нуждались в сложном вычислительном сшивании, чтобы собрать все воедино – исследование, возглавляемое Игорем Писаревым и Стефаном Заальфельдом. « Стивен и Игорь спасли наш бекон », – заявил Бетциг. « Они рассмотрели все ужасные мелкие детали обработки изображений и заставили его работать с каждым набором данных объемом в несколько терабайт ».

В качестве следующего шага соавтор статьи Сригокул Упадхьяюла из Гарвардской медицинской школы и Бостонской детской больницы исследовал объединенные 200 терабайт данных и разработал невероятные фильмы, которые раскрывают тонкости мозга в ярких цветах. Он и его соавторы проанализировали более 1500 дендритных шипов, изобразили жирные оболочки, изолирующие нервные клетки мыши, подчеркнули все дофаминергические нейроны и вычислили все синапсы по всему мозгу мухи.

Из-за нюансов техники расширения, разработанной командой Бойдена, она идеально подходит для микроскопа с решетчатой ​​подсветкой; метод создает практически прозрачные образцы. Для микроскопа это почти как смотреть сквозь воду вместо мутного моря молекулярной грязи. « В результате мы получаем кристально чистые изображения с невероятно высокой скоростью на очень больших объемах по сравнению с более ранними методами микроскопии », – заявил Бойден.

Тем не менее, проблемы остаются. По словам Бетцига, как и при любом типе флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, может быть сложно украсить белки достаточным количеством флуоресцентных ламп для четкого просмотра их с высоким разрешением. Поскольку в расширенной микроскопии задействовано несколько этапов обработки, могут возникать артефакты. представил. Ввиду этого « мы очень усердно работали, чтобы подтвердить то, что мы сделали, и другим было бы неплохо сделать то же самое ». Он заявил

.

В настоящее время Гао и команда Джанелии строят новый решетчатый микроскоп из легких листов, который они планировали перенести в лабораторию Бойдена в Массачусетском технологическом институте. « Мы надеемся быстро составить карты всей нервной системы », – заключил Бойден.

Ученые нанесли на карту местоположение всех синапсов – более 40 миллионов – в мозгу взрослой плодовой мухи. Полмиллиона цветных шариков представляют синапсы, связанные с дофаминергическими нейронами. (Видео любезно предоставлено: Gao et al. / Science 2019)

Source link