24 февраля 2021 года

В этом интервью Шина Д'Арси и Притвиджит Саркар из группы Д'Арси с факультета химии и биохимии Техасского университета в Далласе рассказали News-Medical Life Sciences об использовании SEC-MALS для характеризуют нативное олигомерное состояние белков Nap и их комплексов.

Что такое SEC-MALS?

SEC-MALS – это эксклюзионная хроматография в сочетании с многоугловым светорассеянием. Компонент SEC состоит из насоса HPLC или FPLC, колонки SEC и УФ-детектора поглощения. Аликвота раствора, который обычно содержит смесь различных видов белков, вводится и проходит через насадочную колонку.

Поскольку колонка для исключения размера разделяет белки на основе их размера (гидродинамического радиуса), раствор поступает в УФ-детектор, который измеряет УФ-поглощение каждой элюируемой фракции, создавая хроматограмму.

Каждый пик элюирования на хроматограмме может быть проанализирован для определения высоты пика, формы и объема элюирования, поэтому мы получаем некоторую информацию о белках в исходной смеси, такую ​​как их количество, однородность и оценку их молекулярной массы. Но для получения более количественной информации о молекулярной массе и однородности образцы передаются в детектор светорассеяния.

В нашей лаборатории используется прибор miniDAWN MALS от Wyatt Technology, соединенный с детектором дифференциального показателя преломления (dRI) Optilab, также от Wyatt. MiniDAWN – это трехугольный детектор светорассеяния, который может определять молекулярную массу от нескольких сотен дальтон до 10 миллионов дальтон, а также может измерять размер молекулы (среднеквадратичный радиус) от 10 до 50 нм.

Детектор dRI измеряет изменение показателя преломления относительно чистого буфера, который анализируется для определения концентрации наших белков. Он похож на УФ-детектор, но с тем преимуществом, что нет необходимости знать, какой белок элюируется, или коэффициент поглощения каждого типа, так как реакция dRI почти одинакова для почти всех белков. MALS-анализ молекулярной массы требует данных как по светорассеянию, так и по концентрации.

Теперь все эти системы подключены к компьютеру, на котором мы собираем, визуализируем, обрабатываем и анализируем данные. Мы используем программное обеспечение под названием ASTRA, также от Wyatt. Он удобен и прост в использовании. Обработка данных в ASTRA занимает от пяти до 10 минут после того, как вы освоитесь, и это последний компонент в нашей настройке SEC-MALS.

Каков принцип SEC-MALS?

SEC или эксклюзионная хроматография включает пропускание раствора через колонку, заполненную материалом, имеющим множество пор. Более мелкие молекулы проводят больше времени, диффундируя в порах и из них, и поэтому они элюируются из колонки позже, чем более крупные молекулы, которые фактически не могут поместиться в некоторые из пор. Эта технология разделяет наши белки или смеси на основе диффузионных свойств, на которые влияют размер и форма, в первую очередь гидродинамический радиус. Во многих, но далеко не во всех случаях, молекулярная масса зависит от гидродинамического радиуса, поэтому принято оценивать молекулярную массу по времени, которое требуется каждой фракции для элюирования из колонки.

Фракции, выходящие из колонки и УФ-детектора, попадают в систему светорассеяния. Здесь лазер освещает раствор по мере его прохождения, и свет рассеивается белками или чем-либо, что отличается по оптическим свойствам от буфера (также известного как подвижная фаза). Рассеянный свет измеряется тремя фотодиодами miniDAWN, а сигналы анализируются для определения молекулярной массы (MW) каждую секунду или около того во время элюирования.

Формула, использованная в расчетах, учитывает, что измеренная интенсивность рассеянного света пропорциональна молекулярной массе белка, концентрации и приращению показателя преломления dn / dc.

Приращение рефракции – известная величина, которая предполагается постоянной для всех белков в типичных водных буферах; Концентрация может быть измерена УФ-детектором, но чаще используется сигнал детектора dRI, поскольку он не зависит от конкретного белка. Поэтому, если известны интенсивность рассеяния, концентрация и dn / dc, мы получаем молекулярную массу в каждый момент времени по каждому пику на хроматограмме.

Почему вы решили использовать SEC-MALS?

Из кристаллографии мы заметили, что C. elegans Nap1 (или червь Nap1) и S. cerevisiae Nap1 (или дрожжевой Nap1) очень похожи по структуре, но мы хотели посмотреть на различия и разные свойства раствора. SEC-MALS позволяет нам это сделать.

Nap-белки являются димерами, но также олигомеризуются в зависимости от соли, так что универсальность буфера была еще одним важным фактором, который мы должны были учитывать. SEC-MALS позволяет нам запускать наши образцы в разных буферах, с разными солями и значениями pH, что было очень важно для этой белковой системы. Кроме того, требуется небольшое количество белка, в отличие от других методов, таких как аналитическое ультрацентрифугирование, для которого требуется ~ 1 мл образца. SEC-MALS требует всего 0,1 мл образца при действительно низкой концентрации белка.

Другим важным фактором было то, что белки не нужно модифицировать для SEC-MALS. Многие методы требуют какой-либо мутации или модификации, например, флуоресцентной метки, но SEC-MALS в этом не нуждался, и это было хорошо, потому что наш белок Nap1 червя ранее не был охарактеризован, поэтому мы хотели изучить его в состоянии дикого типа.

Замечательно визуализировать гетерогенность белков Nap с помощью SEC-MALS, поскольку они образуют олигомеры. Это замечательно не только визуализировать, но и количественно оценить, получив молекулярную массу по пику, чтобы можно было оценить степень однородности или неоднородности.

Насколько легко получить данные из SEC-MALS?

Сбор данных из SEC-MALS был быстрым, легким и понятным, а обработка данных занимала всего около 5-10 минут после каждого запуска. Но самое главное, что SEC-MALS позволяет нам визуализировать абсолютную стехиометрию (в отличие от относительной стехиометрии) наших белковых комплексов.

Абсолютная стехиометрия – это фактическое количество белков в комплексе, скажем, четыре Nap, связанных с двумя гистонами, или комплекс 4: 2, тогда как относительная стехиометрия – это просто соотношение, поэтому можно сказать, что всего 2: 1. Он также может определять олигомерное состояние несложных белков. Эти способности отличают SEC-MALS от большинства других биофизических методов.

<img alt=" ДНК-гистоновый комплекс "height =" 794 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2021/2/shutterstock_1788714581.jpg "title =" ДНК -histone complex "width =" 1000 "/>

Комплекс ДНК-гистон. Изображение предоставлено: Владимир Дворник / Shutterstock.com

Что такое гистоны?

Гистоны – это основные белки, составляющие ядро ​​нуклеосомы. Есть две копии H3-H4 и две копии H2A-H2B, которые вместе образуют октамер. ДНК обвивается вокруг этого октамера, образуя нуклеосому. Нуклеосома является структурной и функциональной единицей хроматина, а белки сборки нуклеосом, или Naps, связываются с этими гистонами и регулируют сборку и разборку нуклеосом. В целом они регулируют архитектуру хроматина и важны для различных ядерных активностей.

Гистоны могут существовать как отдельные объекты и стабильны сами по себе. Гистоны H3 и H4 образуют гетеротетрамер, а гистоны H2A-H2B образуют гетеродимер. Ранее мы узнали, что белки Nap являются конститутивными гомодимерами и склонны к олигомеризации в зависимости от соли.

Затем мы изучаем олигомеризацию комплексов Nap1-гистон с помощью SEC-MALS и определяем стехиометрию этих комплексов.

<img alt=" histone "height =" 991 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2021/2/shutterstock_426380029.jpg "title =" histone "width =" 1000 " /> Иллюстрация хромосомы и гистонов с обернутой вокруг них ДНК. Изображение предоставлено: lanatoma / Shutterstock.com

Не могли бы вы рассказать о плане эксперимента, чтобы дать читателям понимание олигомеризации и стехиометрии комплексов Nap1-гистон?

В этой системе SEC-MALS мы сначала вводим 20 мкМ Nap1 в колонку, предварительно уравновешенную 300 мМ NaCl. Наш следующий образец – Nap1, но с титрованием H2A-H2B или H3-H4. Наши образцы будут включать титры гистонов в молярных эквивалентах 0,5, 1,5 и 2,0 до Nap1. Хроматограммы показывают, что наблюдается не только увеличение высоты пика, но также смещение пика влево, что указывает на образование более крупного белкового комплекса.

Если это не было достаточно очевидным, у нас также есть следы MW, которые увеличиваются при титровании гистонов до Nap1. Мы сравниваем наблюдаемые следы молекулярной массы с теоретической молекулярной массой комплексов Nap1-гистон, или комплексов Nap1-гистон 2: 1 или комплексов Nap1-гистон 2: 2, и проводим сравнения для определения стехиометрии наших белковых комплексов.

Связывает ли червь Nap1 H2A-H2B иначе, чем дрожжевой Nap1?

Мы видели, что, когда мы титровали H2A-H2B до червя Nap1, пик сдвигался влево, указывая на формирование более крупного комплекса. Первоначально наблюдалось увеличение высоты пика, но со временем он достиг насыщения в более высоких точках титрования. Наряду с этим мы увидели, что след MW достиг комплекса со стехиометрией Nap1: H2A-H2B 2: 1. При дальнейшем титровании, превышающем эквимолярное количество (1,5 и 2,0 молярных эквивалента), следовая молекулярная масса не превышала 2: 1, и наблюдался пик свободного H2A-H2B.

Мы не получили кривую молекулярной массы пика H2A-H2B, потому что эти белки малы и имеют низкий LS-сигнал, следовательно, связанная с ним ошибка немного выше, и мы не сообщаем о них. Однако мы уверены, что это H2A-H2B, потому что это всего лишь двухбелковая система; выходит H2A-H2B.

Мы сравнили этот результат с дрожжами Nap1 и заметили разницу. Когда мы титровали H2A-H2B до Nap1 дрожжей, мы увидели, что высота пика постоянно увеличивалась, и не только это, но затем кривая MW сначала достигла стехиометрии Nap1: H2A-H2B 2: 1 и в конечном итоге начала приближаться к 2: 2 комплекс.

Кривая MW не достигла насыщения, что указывает на то, что дрожжи Nap1 были способны связывать вторую копию H2A-H2B, но эти комплексы были очень динамичными и происходил постоянный обмен между 2: 1 и 2: 2 дрожжевой комплекс Nap1: H2A-H2B.

В заключение, червь Nap1 имеет сложную стехиометрию 2: 1 с H2A-H2B, однако дрожжи Nap1-H2A-H2B могут иметь стехиометрию 2: 2 или стехиометрию 2: 1.

Что показали ваши эксперименты о взаимодействии Nap1 и H3-H4?

Когда мы титруем H3-H4 до червя Nap1, мы видим, что наблюдается большой сдвиг пика влево, а также увеличение высоты пика при увеличении титрования. Это само по себе просто указывает на формирование большого белкового комплекса. Однако, когда мы смотрим на кривые молекулярной массы, мы видим, что кривые молекулярной массы приближаются к комплексу 4: 2 в начале титрования, и по мере продвижения вверх мы наблюдаем, что комплексная стехиометрия достигает 4: 6 Nap1: H3. -H4 комплекс.

Точно так же с дрожжами Nap1 мы наблюдали ту же тенденцию, когда мы видим большой сдвиг пика влево, увеличение высоты пика, а также стехиометрию, достигающую 4: 6 комплекса Nap1: H3-H4. Интересно отметить, что оба белка Nap ведут себя одинаково и олигомеризуются с H3-H4, и мы предполагаем, что белковый комплекс под пиком образует гетерогенную смесь в динамическом равновесии, которая постоянно обменивается между различными состояниями.

Интересно также отметить, что способ связывания H2A-H2B у этих двух белков Nap различается, потому что червь Nap1 связывается с H2A-H2B со стехиометрией 2: 1, тогда как дрожжевой Nap1 связывается с H2A-H2B со скоростью 2 : 2 или стехиометрия 2: 1. В случае H3-H4 оба белка Nap имеют тенденцию к олигомеризации. Мы предполагаем, что олигомеризация опосредована тетрамеризацией H3-H3, поэтому мы попытаемся определить абсолютную стехиометрию этих белков Nap с H3-H4.

Мы ввели точечные мутации в остатки 110, 126 и положение 130 на H3 и заменили их на аланины, и обнаружили, что H3-H4 больше не может тетрамеризоваться и остается исключительно димерным. Мы называем этот мутант H3-H4 «DM-H3-H4» или димерный мутант H3-H4. Затем мы проводим эксперименты с SEC-MALS, чтобы увидеть олигомеризацию и стехиометрию комплексов Nap1-DM-H3-H4.

Наше предсказание подтвердилось – комплекс Nap1 и H3-H4 олигомеризуется из-за тетрамеризации H3-H4. Мы увидели, что когда мы титровали DM-H3-H4 до нашего червя или дрожжевого Nap1, первоначально мы получили комплекс 2: 1, но при дальнейшем титровании мы увидели, что комплекс приближается к стехиометрии 2: 2 для обоих этих белков Nap.

Мы не наблюдали стехиометрии / олигомеризации 4: 2 и 4: 6, что означает, что мутация, внесенная в H3-H4, отменила не только тетрамеризацию H3-H4, но и олигомеризацию более высокого порядка комплексов Nap1-H3-H4. также. Точно так же мы видели, что червь и дрожжи Nap1 вели себя одинаково. Их комплексная стехиометрия составляет 2: 2 с DM-H3-H4.

Чтобы подвести итог нашей работы, в этом исследовании мы охарактеризовали Nap1 из C. elegans биохимически и структурно. Его структура почти идентична ядру дрожжевого домена Nap1. Дрожжи Nap1 обладают кислым N-концевым и С-концевым хвостом, тогда как у червя Nap1 этот N-концевой хвост естественным образом отсутствует и имеется только короткий С-концевой хвост. Из-за высокой консервативности последовательности в коровом домене мы думали, что червь Nap1 будет отличной моделью белка для изучения и изучения роли хвостов в самоолигомеризации Nap1, связывании гистонов и стехиометрии комплексов, связанных с гистонами.

Используя SEC-MALS, мы обнаружили, что червь Nap1 может связывать только одну копию H2A-H2B, тогда как дрожжевой Nap1 может связывать одну или две копии H2A-H2B. Исследование предполагает, что вторая копия H2A-H2B может быть связана с N- или C-концевым хвостом, который присутствует в Nap1 дрожжей. Когда белки Nap связывают H3-H4, они образуют олигомерные комплексы более высокого порядка со стехиометрией 4: 2 или 4: 6. Это похоже как на червя Nap1, так и на дрожжи Nap1.

Мы предположили, что поверхность раздела тетрамеризации H3-H4 вызывает образование больших олигомерных комплексов. Когда мы мутируем их с образованием исключительно димерного H3-H4, мы теряем олигомеризацию комплексов Nap-гистон и обнаруживаем абсолютную стехиометрию комплекса Nap1: H3-H4 2: 2 как у червя Nap1, так и у дрожжей Nap1.

<img alt=" c. elegans "height =" 710 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2021/2/shutterstock_167561036.jpg "title =" c. elegans "width =" 1000 "/> Nap1 круглого червя C. elegans был охарактеризован биохимически и структурно. Изображение предоставлено: Heiti Paves / Shutterstock.com

Что было одним из самых важных вещей, которые SEC-MALS позволяли вам делать в вашей работе?

Я думаю, мы можем оценить очень прямой подход SEC-MALS – он дал довольно много понимания того, как белки Nap связывают гистоны.

SEC-MALS позволил нам охарактеризовать нативное олигомерное состояние белков Nap и их комплексов. У нас не было очень простой системы, поскольку у нас были олигомеры с высокой аффинностью, динамическая самоассоциация и зависимость от условий буфера, но мы смогли справиться со всем этим с помощью SEC-MALS.

Возможно, наиболее важным было то, что SEC-MALS дал нам абсолютную стехиометрию наших комплексов. Мы смогли получить это, проанализировав ряд стехиометрических соотношений. Это примечательно, так как большинство методов определяют только относительные стехиометрические отношения. Это было важно для белков Nap и гистонов, поскольку уже известно, что некоторые из них олигомеризуются как внутри, так и вне их комплекса.

У нас есть прибор SEC-MALS в нашей лаборатории всего несколько лет, но он используется почти постоянно, и студенты знают, как им пользоваться, благодаря Университету рассеяния света Wyatt Technology, который Притвиджит посетил в 2017 году. и сочли чрезвычайно полезным.