Возможность использования сухих реагентов LAMP-анализа для обнаружения SARS-CoV-2

Возможность использования сухих реагентов LAMP-анализа для обнаружения SARS-CoV-2

Исследователи оценивают метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) с использованием сухих реагентов для выявления тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-CoV-2). Они обнаружили, что тестовый набор очень специфичен и чувствителен. Этот метод может позволить провести диагностику прямо в месте оказания медицинской помощи в недорогих условиях.

Быстрое распространение пандемии COVID-19, вызванной вирусом SARS-CoV-2, потребовало разработки диагностических методов, которые могут быстро определить, инфицирован ли пациент этим вирусом. Быстрое обнаружение вируса имеет важное значение, поскольку многие симптомы инфекции, такие как лихорадка и кашель, похожи на сезонный грипп или другие респираторные заболевания. Кроме того, у многих пациентов симптомы легкие или бессимптомные.

Наиболее часто используемый тест – это полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР). Для этого метода требуется специальный термоциклер и прецизионная оптика для измерения испускаемой флуоресценции образцов. Эти требования обычно исключают его использование в местах оказания медицинской помощи (POC).

Другой метод, называемый петлевой изотермической амплификацией (LAMP), позволяет амплифицировать ДНК в изотермических условиях с высокой специфичностью и чувствительностью. Этот метод дешевле и быстрее, чем RT-PCR, и использовался при тестировании POC многих заболеваний.

<img alt=" Просвечивающая электронная микрофотография частиц вируса SARS-CoV-2, выделенных у пациента. Изображение получено и обработано цветом в Комплексном исследовательском центре NIAID (IRF) в Форт-Детрике, штат Мэриленд. Предоставлено: NIAID "height =" 1800 "src =" http://www.news-medical.net/image.axd?picture=2020%2f10%2f49645120251_1e39cea47b_o_(4).jpg "title =" Электронная микрофотография SARS- Частицы вируса CoV-2, выделенные от пациента. Изображение получено и обработано цветом в Комплексном исследовательском центре NIAID (IRF) в Форт-Детрике, штат Мэриленд. Кредит: NIAID "width =" 1800 "/>

Просвечивающая электронная микрофотография частиц вируса SARS-CoV-2, выделенных у пациента. Изображение получено и обработано цветом в Комплексном исследовательском центре NIAID (IRF) в Форт-Детрике, штат Мэриленд. Предоставлено: NIAID

Тестирование анализа LAMP с сухими реагентами

В новом исследовании, опубликованном на сервере препринтов medRxiv *, исследователи оценили пригодность набора для обнаружения SARS-CoV-2 Loopamp от Eiken Chemica, Япония, для обнаружения SARS-CoV-2. Это метод LAMP, в котором для амплификации РНК используются сухие реагенты.

Сухие реагенты более стабильны, чем жидкие реагенты, не требуют морозильной камеры для хранения и с ними легче обращаться.

Это позволит использовать метод в недорогих и развивающихся странах, поскольку реагенты могут храниться в холодильнике при температуре около 4 ° C и не требуют строгой транспортировки и хранения в холодовой цепи.

Для оценки метода LAMP исследователи сначала извлекли РНК из мазков из носа и горла пациентов. Они выполнили обратную транскрипцию (RT) -LAMP с использованием набора для обнаружения Loopamp SARS-CoV-2 от Eiken Chemical.

Все реагенты, за исключением праймеров, сушат и иммобилизуют внутри крышки пробирки. Авторы добавили очищенную РНК, и специфический праймер SARS-CoV-2 закрепился на дне пробирки и несколько раз встряхнул пробирку, чтобы ресуспендировать фермент и буфер. Они инкубировали смесь, собранную на дне пробирки вращением вниз, в течение 35 минут при 62,5 ° C.

Чтобы проверить чувствительность набора, авторы протестировали 22 вируса, в том числе коронавирус SARS, коронавирус ближневосточного респираторного (MERS) синдрома, другие коронавирусы человека и вирусы гриппа.

Они не наблюдали никакой амплификации вирусов, кроме SARS-CoV-2, что указывает на то, что тест был специфичен для вируса. Исследователи подтвердили эти результаты, используя анализ мутности и анализ электрофореза в агарозном геле.

Чтобы определить чувствительность теста, исследователи использовали in vitro транскрибированную РНК, серийно разведенную в буфере, и использовали РНК-носитель в концентрации 50 нг / мл для определения предела обнаружения.

Предел обнаружения, установленный авторами, составлял 10 копий на реакцию с использованием анализов мутности и изменений цвета, наблюдаемых невооруженным глазом, и с использованием УФ-освещения. Это аналогично или немного выше, чем у тестов LAMP для SARS-CoV-2.

Клинические образцы

Авторы также оценили свой тест с использованием 24 клинических образцов, в которые вошли три бессимптомных человека, которые находились в тесном контакте с пациентами с COVID-19. Образцы были собраны в период с 7 марта по 30 апреля 2020 г.

При использовании ОТ-ПЦР 19 из 24 образцов дали положительный результат на SARS-CoV-2, тогда как 15 образцов показали положительные результаты с использованием теста LAMP, оцененного авторами.

Четыре ложноотрицательных образца, собранные более чем через 7 дней после начала заболевания, содержали низкие копии вирусной РНК менее 10 копий на реакцию, что является пределом обнаружения нового теста. Два из четырех ложноотрицательных образцов были собраны на 18 и 20 день, чтобы подтвердить отсутствие вируса перед выпиской из больницы.

Следовательно, авторы рассчитали специфичность, чувствительность, положительную прогностическую ценность и отрицательную прогностическую ценность как 100%, 78,9%, 100% и 55,6% соответственно.

«Учитывая, что и анализ мутности, и колориметрические изменения выявили все образцы с более чем 4,4 копиями на реакцию, мы считаем, что этот метод сухой LAMP SARS-CoV-2 надежен для клинического использования при диагностике COVID-19», – пишут авторы. .

В предыдущем исследовании сообщалось, что РНК SARS-CoV-2 можно амплифицировать в анализе LAMP без экстракции. Включение такого метода без экстракции РНК может помочь в версии метода прямого обнаружения для тестов POC.

* Важное примечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.

Source link