18 декабря 2020 года

Поскольку пандемия коронавирусного заболевания 2019 (COVID 19) продолжает оказывать свое влияние на мир, для эпиднадзора за заболеванием срочно требуются методы быстрого тестирования для обнаружения РНК.

В новом документе, который появился в качестве препринта на сервере medRxiv * в декабре 2020 года, описан тест на нуклеиновую кислоту, подтвержденный на образцах слюны. В принципе, в этом тесте используется амплификация вирусной нуклеиновой кислоты с последующим обнаружением, опосредованным Cas13, в сочетании с лизисом образца недорогими реагентами длительного хранения без необходимости выделения РНК.

<img alt=" Схема примера DISCoVER для рабочего процесса "height =" 771 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2020/12/Capture29.jpg "title = "Схема примера DISCoVER для рабочего процесса" width = "2037" />

Схема рабочего процесса DISCoVER для ответов. Кредит изображения:

Этот тест имеет высокую чувствительность и специфичность и может использоваться с несколькими зондами CRISPR для обнаружения человеческого гена или других патогенов вместе с целевым вирусом. Названный DISCoVER (DiagnosticS with Coronavirus Enzymatic Reporting), это тест на SARS-CoV-2, который не требует выделения РНК. В этом его отличие от других тестов на основе CRISPR, таких как DETECTR и STOPCovid V2, в которых используются LAMP и Cas12.

Во-вторых, DISCoVER избегает взятия проб из верхних дыхательных путей, поскольку основывается на образцах слюны. Было описано использование образцов слюны, чтобы избежать контактов медицинского работника с пациентом. Они согласуются с мазками из носоглотки в 97% случаев при тестировании с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-qPCR).

Проблемы стандартной количественной ПЦР

После заражения коронавирусом-1 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) наступает бессимптомная фаза, когда вирус реплицируется в инфицированных клетках-хозяевах и распространяется на другие части легких и реснитчатые клетки носовые дыхательные пути. На следующем этапе вирусная продукция становится экспоненциальной, и человек становится заразным, хотя часто бессимптомно или бессимптомно.

Когда наступает симптоматическая фаза, вирусная нагрузка в верхних дыхательных путях обычно падает со своего пика, и уровень положительности нуклеиновых кислот, соответственно, ниже. Так как это фаза, когда наблюдается максимальная частота тестирования, многие тесты могут давать ложноположительные результаты.

Более того, стандартные тесты, такие как количественная ПЦР (qPCR), требуют сложного оборудования, обученного персонала и времени. Долгое время, необходимое для возврата результата теста, делает эти тесты непригодными для диагностики POC.

Необходимость быстрых тестов POC

Самый эффективный способ разорвать цепочку передачи – это регулярное тестирование с использованием экспресс-тестирования в месте оказания помощи (POC) через короткие промежутки времени. Опять же, быстрое тестирование можно использовать для выявления положительных результатов на уровне сообщества, которые подтверждаются более конкретными тестами после направления.

В-третьих, наличие более чем одного или нескольких методов тестирования могло бы предотвратить узкие места в диагностической сети за счет предоставления альтернативных наборов для отбора проб и тестирования.

Ранее исследователи разработали методы количественной ПЦР без предварительной экстракции РНК с тепловым лизисом образца. Также использовались хаотропные агенты, ингибиторы РНКаз и восстановители.

Принципы испытаний

Обнаружение на основе CRISPR и изотермическая амплификация – это методы, которые можно комбинировать с прямым лизисом и взятием образцов слюны для диагностического тестирования POC. CRISPR-опосредованное обнаружение вирусной РНК зависит от использования направляющей РНК для активации Cas13 или Cas12, которые являются нуклеазами. Эти активированные ферменты вырабатывают неспецифические нуклеазы против одноцепочечной (ss) РНК или ДНК, тем самым расщепляя связанную репортерную молекулу и обеспечивая ее высвобождение. Обнаружение этого репортера затем дает результаты теста.

Преимущество тестирования на основе CRISPR заключается в его высокой специфичности. Однако использование только нуклеаз Cas13 может задержать аттомолярную чувствительность до двух часов. Чтобы преодолеть это, они использовали изотермическую амплификацию, опосредованную петлей (LAMP), которая является одновременно быстрой и высокочувствительной, для обнаружения при аттомолярной чувствительности требуется менее 20 минут

.

С помощью LAMP первая вирусная РНК подвергается обратной транскрипции в ДНК с использованием комбинации обратной транскриптазы, ДНК-полимеразы, замещающей цепь, и трех пар праймеров. Затем ДНК подвергают воздействию LAMP.

В текущем исследовании промоторы РНК-полимеразы были интегрированы в праймеры LAMP, так что амплифицированная ДНК могла быть транскрибирована в одноцепочечную РНК, которая распознается зондом Cas13. Это приводит к амплификации LAMP до РНК или rLAMP. Поскольку каждый продукт LAMP транскрибируется РНК-полимеразой, как только образуется, пик сигнала Cas13 составляет менее пяти минут соответственно. Его предел обнаружения (LOD) аттомолярный.

В текущем эксперименте они исследовали девять наборов праймеров LAMP, которые были нацелены на различные области генома SARS-CoV-2, и обнаружили, что все они производили положительные сигналы, когда они нацелены на геномную РНК в количестве 100 копий / мкл. Пик флуоресценции достигал 20 минут, а для трех серий – 15 минут.

Этот метод, однако, требует поправки на неспецифическую амплификацию, возможно, результат димеризации праймера. Эта коррекция была обеспечена за счет использования специального зонда Cas13 для специфического распознавания амплифицированной нуклеиновой кислоты, таким образом сочетая чувствительность со специфичностью.

Исследователи выбрали набор праймеров N 1, который распознает ген нуклеокапсида (N) SARS-CoV-2, как потому, что он имеет низкое время до порогового значения, так и потому, что его ампликон достаточно велик, чтобы соответствовать руководству Cas13. РНК. Набор праймеров N set 1 имеет LOD 25 копий / мкл.

Каковы последствия?

Текущее исследование, таким образом, описывает необычную комбинацию двух механизмов амплификации, повышающих чувствительность теста, с зондом Cas13 для определения специфичности. Усиление LAMP занимает 20-30 минут.

Использование обычных, недорогих и легко доступных реагентов для прямого лизиса при комнатной температуре упрощает процедуру. Исследователи отмечают, что простота и удобство сбора слюны для тестирования COVID-19, вероятно, приведет к более высокому уровню тестирования и более частому тестированию, включая бессимптомное тестирование. Это связано с тем, что образцы слюны имеют сопоставимые титры вирусов с мазками из верхних дыхательных путей. Однако последний также может использоваться с рабочим процессом DISCoVER.

В исследовании подтверждается обнаружение SARS-CoV-2 в матрице образцов на основе слюны с использованием живого вируса параллельно с человеческим геном в качестве контроля. Более того, способность использовать разные нуклеиновые кислоты позволяет адаптировать его для обнаружения множества патогенов, таких как грипп A и B.

Использование слюны, обнаружение без экстракции РНК и возможность множественного обнаружения мишеней делают его отличным кандидатом для разработки диагностического теста POC для COVID-19.

Дальнейшая интеграция с микрожидкостной платформой и устройством обнаружения упростит частое тестирование в школах и на рабочих местах как часть надежной инфраструктуры для надзора за пандемией ».

* Важное примечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.