В недавней и своевременной статье, которая в настоящее время доступна на сервере препринтов bioRxiv * исследователи из Израиля и Франции продемонстрировали, как in vitro эволюция тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 ( SARS-CoV-2) рецептор-связывающий домен (RBD) следует за распространением заразной мутации, но также может генерировать эффективный ингибитор инфекции.

Как структурные, так и функциональные исследования показали, что одного RBD гомотримерного гликопротеина SARS-CoV-2 достаточно для взаимодействия с вирусным рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE-2).

Процесс связывания и последующее расщепление протеазой хозяина, трансмембранной сериновой протеазой 2 (TMPRSS2), приводит к слиянию клеточной и вирусной мембран и приводит к проникновению в клетку. Следовательно, этого можно избежать, блокируя рецепторы ACE2 специфическими антителами.

Также играет роль повышенное сродство к рецептору, которое (по крайней мере частично) отвечает за инфекционность SARS-CoV-2. Недавно появившиеся вирусные мутации в RBD шипового гликопротеина подтвердили эту гипотезу

.

И теперь мы сталкиваемся с конкретными примерами. «Британская» мутация (N501Y или вариант B.1.1.7) была предложена для усиления связывания с ACE2 на основе анализа мутаций с глубоким секвенированием. Точно так же «южноафриканский» вариант (501.V2), который включает K417N, E484K и N501Y, быстро распространяется и превращается в доминирующую линию в провинциях Восточный Кейп и Западный Кейп

Следовательно, потенциальные мишени для лечения, которые направлены на прекращение проникновения вируса в клетки, должны включать молекулы, блокирующие спайковый гликопротеин, рецептор ACE2 или протеазу TMPRSS2. Соответственно, недавно были предложены и разработаны множественные нейтрализующие антитела с высокой аффинностью.

Стратегия отбора дрожжевого дисплея

Примечательно, что сам домен RBD может использоваться в качестве эффективного конкурентного ингибитора сайта связывания рецептора ACE2. Тем не менее, его сродство должно быть существенно оптимизировано, чтобы оно работало – в основном, оно должно достигать пикомолярного сродства.

Недавно была разработана усовершенствованная стратегия дрожжевого дисплея, основанная на слиянии C- и N-концевых исключительно ярких цветов флуоресценции, которые позволяют наблюдать экспрессию на мельчайших уровнях, позволяя перейти к пикомолярным концентрациям приманки.

В этом исследовании группа исследователей (во главе с доктором Йиржи Заградником из Научного института Вейцмана в Реховоте, Израиль) решила использовать две разные стратегии обнаружения, основанные на репортерах eUnaG2 и DnbALFA, адаптированных к поверхностному воздействию, и исключить утомительную очистку ДНК шаг.

Для оптимальной экспрессии на поверхности перед конструированием библиотеки тестировали RBD различных размеров. Криоэлектронная микроскопия высокого разрешения использовалась для определения структуры RBD, которая затем использовалась для оценки электростатической комплементарности.

Более жесткая привязка к ACE2

Это исследование показало, что отобранные естественным путем мутации S477N, E484K и N501Y гликопротеина шипа RBD, которые, как известно, придают более высокую инфекционность, были фактически отобраны в результате созревания аффинности поверхности дрожжей в первом раунде, давая начало E484K, N501Y, Южноафриканские и британские варианты с 3,5-кратным более плотным связыванием с ACE2 по сравнению с RBD дикого типа.

Кроме того, после трех дополнительных раундов селекции на дрожжевом дисплее связывание было в 600 раз более плотным по сравнению с RBD дикого типа. Этот процесс отбора основывался на комбинаторном отборе без ущерба для стабильности белка.

«График аффинности связывания с ACE2 выбранных мутаций RBD в зависимости от их встречаемости в популяции показывает сильную корреляцию между ними», – говорят авторы этого исследования. «Дальнейшая эволюция in vitro, увеличивающая связывание в 600 раз, дает рекомендации в отношении потенциально новых развивающихся мутаций с еще более высокой инфекционностью», – добавляют они

.

Кроме того, исследователи также оценили роль высокоаффинного связующего RBD-62 в качестве потенциального терапевтического агента и показали, что он может компетентно блокировать ACE2, не влияя на его заметную и необходимую ферментативную активность.

Интригующие вопросы и выводы

Несмотря на то, что естественный отбор вирусов не так эффективен по сравнению с отбором in vitro полученная информация о наиболее критических мутациях может быть использована как инструмент для быстрой идентификации возникающих мутаций.

«Возникает интересный вопрос, является ли случайным распространение более прочно связывающихся вариантов SARS-CoV-2 у людей», – говорят авторы исследования в этой статье bioRxiv . «Исходя из сходства с отбором дрожжевых дисплеев, где используются строгие условия, можно предположить, что строгий отбор также способствует быстрому распространению этих мутаций», – добавляют они.

Наиболее распространенные низкокачественные маски для лица фактически обеспечивают такие условия отбора, поскольку они снижают титры выдыхаемых вирусов, обеспечивая более прочным вариантам связывания преимущество перед дикими типами для быстрого распространения в популяции.

И это то, что необходимо срочно изучить, поскольку маски для лица более высокого качества могут стать обязательными для снижения титров вируса ниже уровня инфицирования (что на самом деле имеет место в случае с медицинским персоналом) и остановить распространение этих более прочно связывающихся вирусных мутаций. .

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.