Автор: Хелен Русторн, доктор философии, старший научный руководитель, Albumedix

Текущая глобальная пандемия пролила свет на важность диагностического тестирования, особенно на COVID-19. Поскольку коронавирус продолжает распространяться по всему миру, как никогда важно сосредоточить усилия на выявлении инфицированных, чтобы задержать и остановить распространение инфекции. Необходимы скоординированные усилия для ускорения исследований, и, хотя внедрение вакцины все еще находится на начальной стадии, мир более осведомлен о том, насколько надежное диагностическое тестирование является ценным инструментом для спасения жизней.

Поскольку количество разрабатываемых диагностических тестов находится на рекордно высоком уровне, а коммерческие успехи делают заголовки мировых новостей, отрасль добивается значительного прогресса. Но этот многообещающий рост сопровождается серьезными проблемами. Наиболее хорошо задокументированным из них является снижение затрат при максимальном увеличении производительности, однако одна область, которая становится все более важной, особенно в отношении тестирования COVID-19, – это надежность, более быстрое тестирование и скорость получения результатов.

Доступно множество хорошо зарекомендовавших себя диагностических тестов на COVID-191. К ним относятся: 1) полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) – текущий стандартный тест, 2) петлевая изотермическая амплификация (LAMP) – простой, но менее разработанный тест, 3) боковой поток – ручной одиночный. использовать анализы, дающие результаты всего за 15 минут, и 4) твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) – технически простые анализы, которые легко считываются и обеспечивают относительно высокую производительность. Каждый день все больше тестов получают экстренное одобрение, и новые методы продолжают прокладывать себе путь через конвейер разработки, чему способствует огромный скачок в понимании медицины, увеличение государственных расходов и рост числа случаев COVID-19.

Многие из этих диагностических тестов становятся все меньше и быстрее, но можно ли сделать больше для повышения точности, надежности и скорости результатов?

Проблемы диагностических тестов

ПЦР, ОТ-ПЦР, LAMP и RT-LAMP являются наиболее распространенными способами тестирования на патогены.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для «амплификации» небольших сегментов ДНК. После амплификации ДНК, полученная с помощью ПЦР, может использоваться во многих различных лабораторных процедурах, включая обнаружение вирусов. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) используется, когда исходным материалом является РНК. В этом методе РНК сначала транскрибируется в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы из общей РНК или информационной РНК (мРНК). Затем кДНК используют в качестве матрицы для реакции ПЦР. ОТ-ПЦР используется во множестве приложений, включая обнаружение патогенов.

LAMP (изотермическая амплификация, опосредованная петлей) – это однотрубный метод амплификации ДНК. Он представляет собой недорогую альтернативу технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения определенных заболеваний. Он включает в себя разработку праймеров для анализа и использование полимеразы, замещающей цепи, чтобы обеспечить быструю амплификацию при постоянной температуре без необходимости термоциклирования (требуется для ПЦР). Типичная реакционная смесь LAMP содержит 6 праймеров, которые нацелены на 8 областей бактериального или вирусного генома. В RT-LAMP вместо ДНК обнаруживаются последовательности РНК. К смеси LAMP добавляется обратная транскриптаза, чтобы преобразовать вирусную РНК в комплементарную кДНК, которая будет использоваться для амплификации. Эта процедура оказала большую помощь в диагностике множества РНК-вирусов.

Одним из важнейших элементов всех этих тестов является эффективность усиления. Полный потенциал диагностической ПЦР частично ограничен присутствием ингибиторов в сложных биологических образцах, которые снижают эффективность амплификации2. Ингибиторы также могут влиять на чувствительность анализа или даже приводить к ложноотрицательным результатам3

Для усиления амплификации ДНК можно использовать различные вспомогательные средства амплификации, такие как казеин и формамид. Органические растворители, включая ДМСО и формамид, часто использовались в качестве добавок для повышения эффективности амплификации последовательностей ДНК с высоким содержанием GC (GC> 60%). Бычий сывороточный альбумин (BSA) использовался в качестве добавки в нескольких приложениях, включая расщепление рестрикционными ферментами, а также в ПЦР-амплификации матриц из проб окружающей среды, которые содержат потенциальные ингибиторы, такие как фенольные соединения. Считается, что БСА связывается с ингибиторами, уменьшая их пагубное влияние на амплификацию.

В определенных сценариях в буфер могут быть включены химические добавки или сорастворители для повышения специфичности амплификации за счет уменьшения ошибочного праймирования и повышения эффективности амплификации за счет удаления вторичных структур. Добавки для ПЦР и усиливающие агенты использовались для увеличения выхода, специфичности и согласованности реакций ПЦР. Эти добавки могут иметь положительное влияние на амплификацию, повышая стабильность ДНК-полимеразы.

Несколько исследований показали преимущества BSA в значительном увеличении выхода ПЦР-амплификации при использовании в сочетании с органическими растворителями, ДМСО или формамидом. Эффекты усиления BSA были получены в нескольких приложениях ПЦР с матрицами ДНК с высоким содержанием GC и охватом широкого диапазона размеров. При добавлении к реакционному буферу стимулирующие эффекты BSA наблюдались в первых циклах ПЦР, независимо от размера амплифицируемой ДНК. Такие результаты демонстрируют экономически эффективную альтернативу для повышения эффективности ПЦР-амплификации ДНК-мишеней, богатых GC, в широком диапазоне размеров 4

Также сообщалось, что BSA снижает адгезию ДНК-полимеразы к стеклянным капиллярам, ​​используемым в некоторых приборах для ПЦР в реальном времени. 5 Это важно для уменьшения потерь реагентов за счет адсорбции на стенках пробирки.

Ученые из New England Biolabs продемонстрировали способность колориметрического анализа LAMP выявлять РНК вируса SARS-CoV-2, вызывающего COVID-19.6. Что касается методов LAMP, могут возникнуть проблемы, когда исходный образец «грязный». Это часто означает, что для подготовки образца требуются дополнительные шаги и процессы, что может занять много времени. BSA может помочь обеспечить более быстрый сигнал, так как усиление происходит быстрее. Кроме того, исследуемый материал не должен быть таким «чистым», поскольку альбумин связывает примеси в реакционной смеси, устраняя необходимость в дополнительных стадиях очистки в процессе.

Однако существуют заметные проблемы с BSA и действительно с некоторыми альбуминами сыворотки человека (HSA). Важно понимать, что не все альбумины созданы одинаково, и различные характеристики продукта могут повлиять на общую производительность, эффективность и безопасность.

Проблемы BSA и HSA

Поиск подходящей добавки, которая повышает эффективность диагностического теста, является неотъемлемой частью процесса разработки и регулирования. Идеальный продукт должен быть чистым и не содержать вирусов. Стабильность и согласованность от партии к партии также являются первостепенными соображениями, поскольку они влияют на производительность, эффективность и безопасность.

BSA и другие рекомбинантные альбумины могут страдать от плохой согласованности от партии к партии. Кроме того, BSA получают от животных, которые могут представлять потенциальный риск заражения вирусом. Качество альбумина важно для обеспечения согласованности от партии к партии, но также альбумин может изменяться из-за присутствия примесей и / или агрегатов. Чистота материалов имеет решающее значение для разработчиков, создающих новое поколение расширенных диагностических тестов, избегая риска получения ложных результатов.

Природные свойства рекомбинантных альбуминов человека (rAlb) делают их естественным выбором в качестве добавок для диагностических тестов. Альбумин, как естественный белок, широко признан безопасным. Кроме того, рекомбинантные версии, не содержащие людей и животных, снижают риск появления неожиданных патогенов до нуля.

rAlb, многофункциональный наполнитель с подтвержденными стабилизирующими свойствами, может играть ключевую роль в обеспечении согласованности и поддержании стабильности и эффективности диагностического теста, чтобы пациенты получали оптимальные результаты. В отличие от человеческого сывороточного альбумина (HSA), полученного из плазмы, и других рекомбинантных альбуминов, Recombumin® предлагает надежный источник альбумина с превосходной стабильностью от партии к партии и надежностью поставок. Наши продукты имеют чрезвычайно низкий уровень посттрансляционных модификаций (ПТМ), непревзойденное качество цГМФ, отвечающее стандартам USP-NF, и были коммерчески одобрены для коммерческих и поздних стадий клинических лекарств и вакцин-кандидатов.

Следовательно, rAlb является естественным выбором, когда важны безопасность, эффективность и надежность.

Nature’s Own Coating

Только высокочистый альбумин, такой как Рекомбумин®, способствует полному использованию потенциала альбумина при одновременном снижении вариабельности и риска. Этот продукт, не содержащий животных и людей, обеспечивает превосходную согласованность между партиями и надежность поставок, обеспечивая безопасность, эффективность, надежность и спокойствие в соответствии с нормативными требованиями.

Recombumin® предлагает более безопасную альтернативу BSA и HSA. Стремление к высококачественным альбуминовым продуктам, не содержащим человеческих и животных компонентов, за последние десятилетия разработало структурно и функционально эквивалентные рекомбинантные версии HSA. HSA, полученный из плазмы, представляет собой различные генетические варианты и проявляет различную степень N-концевого усечения, гликирования и окисления из-за длительного времени пребывания экстрагированных альбуминов в организме. В отличие от HSA, продукты Albumedix rAlb имеют исключительно высокий и стабильный профиль качества.

Часто возникает необходимость избегать приема BSA или альбумина животного происхождения. Было показано, что рекомбинантный человеческий альбумин, как и БСА, предотвращает адгезию ферментов к реакционным пробиркам и поверхностям пипеток. Он также стабилизирует некоторые белки во время инкубации. Человеческий альбумин Рекомбумин® также можно использовать для дезактивации ингибиторов ПЦР.

В качестве диагностической тестовой добавки Рекомбумин®:

• Биологически стабильный
• Химически инертный
• Нетоксичный
• Без растворителей
• Полная нормативная документация
• Соответствует USP-NF
• Производство GMP
• Поставляется готовым к использованию

Ключевые преимущества рекомбинантного человеческого альбумина для тестов на COVID-19

Рекомбумин может обеспечить более эффективные тесты на COVID-19, в том числе диагностические наборы для ПЦР, ОТ-ПЦР, LAMP и RT-LAMP через:

• Экономия драгоценного времени на подготовку образцов; чистота Рекомбумина® может позволить амплификацию происходить с более низкими уровнями матричной ДНК или с «более грязными» образцами
• Предотвращение неспецифической адсорбции реагентов в пробирке для ПЦР
• Может действовать как энхансер, поскольку он связывается с ингибиторами ПЦР
• Может обеспечить более быстрое получение сигнала (LAMP, RT-LAMP)

Благодаря непревзойденной чистоте Рекомбумина® сайты связывания для ингибиторов ПЦР будут свободными (в отличие от BSA или HSA, полученного из плазмы), что, следовательно, сделает тест более эффективным. Подтверждено, что Рекомбумин® не содержит вирусов, что исключает риск ложных срабатываний, которые в противном случае могли бы возникнуть в результате BSA или HSA.

Нормативная поддержка

Компания Albumedix применила свой научный опыт и технологии для поддержки ряда диагностических приложений.

Albumedix может поддержать регистрацию вашего диагностического теста, предоставив вам доступ к нашей высококвалифицированной группе нормативной поддержки. Наша нормативная документация и данные могут помочь облегчить нормативное бремя и удовлетворить требования регулирующих органов.

Работая на специализированном предприятии, мы имеем сертификат GMP от MHRA, и наше предприятие было проверено FDA и Министерством здравоохранения Канады в поддержку приложений клиентов. У нас есть DMF во многих регионах, включая США, и мы можем оказать поддержку в ответах на вопросы регулирующих органов, касающиеся использования альбумина. Предоставляя эти ключевые ресурсы и возможности, Albumedix играет жизненно важную роль в оказании помощи производителям диагностических тестов во всем мире в разработке их передовых технологий.

На пути к будущему диагностических тестов

Успех ПЦР и других диагностических наборов зависит от нескольких факторов, причем компоненты реакции играют решающую роль в амплификации. Рекомбумин предлагает несколько преимуществ: связывание с ингибиторами реакции, устранение дополнительных этапов очистки образца, поскольку он объединяет примеси и покрывает поверхность пробирок, чтобы драгоценный образец не терялся. По мере того как новые диагностические тесты продолжают выходить на рынок, наш опыт и доказательства будут способствовать разработке новых наборов. Наш многолетний опыт в области рекомбинантного человеческого альбумина может быть применен к таким продуктам, и Альбумедикс готов оказать поддержку клиентам в разработке наборов для тестирования COVID-19.

Очевидно, что в этом году наибольшее влияние на нашу отрасль оказала пандемия COVID-19. Поскольку мы поставляем клиентам разработки диагностических средств, медицинских устройств и вакцин для борьбы с коронавирусом, мы пристально следим за этими разработками. Решение проблем, связанных с хранением и транспортировкой холодовой цепи, является центральным вопросом, важным как для обеспечения того, чтобы вакцины от COVID-19 доходили до пациентов во всем мире, так и с проблемой, которую решают разработчики передовой терапии, чтобы сделать терапию масштабируемой. Примером может служить растущая тенденция к "размораживанию и введению" клеточной терапии.

Доступность установленных диагностических наборов позволила исследователям самостоятельно разрабатывать диагностические системы COVID-19. На оптимизацию таких технологий потребовались десятилетия, но сейчас они играют важную роль в выявлении и контроле распространения COVID-19. Рекомбумин® предоставляет улучшенное решение как часть этого набора инструментов для борьбы с этим заболеванием.

Чтобы узнать больше о рекомбинантном человеческом альбумине для диагностических тестов, свяжитесь с нами сегодня.

Ссылки

1. Какие тесты потенциально можно использовать для скрининга, диагностики и мониторинга COVID-19, и каковы их преимущества и недостатки? https://www.cebm.net/covid-19/what-tests-could-potential-be-used-for-the-screening-diagnosis-and-monitoring-of-covid-19-and-what-are- их преимущества и недостатки /
2. Abu Al-Soud W., Rådström P. Влияние фасилитаторов амплификации на диагностическую ПЦР в присутствии крови, фекалий и мяса. J Clin Microbiol. 2000 декабрь; 38 (12): 4463-70. DOI: 10.1128 / JCM.38.12.4463-4470.2000. PMID: 11101581; PMCID: PMC87622.
3. Ингибиторы ПЦР – появление, свойства и удаление https://t.co/gEQViMkNQ8
4. Farell, E.M., Alexandre, G. Бычий сывороточный альбумин дополнительно усиливает влияние органических растворителей на повышенный выход полимеразной цепной реакции GC-богатых матриц. Примечания BMC Res 5, 257 (2012). https://doi.org/10.1186/1756-0500-5-257
5. Плант Д., Беланже Г., Леблан Д., Уорд П., Хоуд А., Троттье Ю. Л.. Использование бычьего сывороточного альбумина для улучшения RT-qPCR обнаружения вирусов пищевого происхождения, смытых с поверхностей овощей. Lett Appl Microbiol. 2011 Март; 52 (3): 239-44. DOI: 10.1111 / j.1472-765X.2010.02989.x. Epub 11 января 2011 г. PMID: 21219370.
6. https://international.neb.com/nebinspired-blog/loop-mediated-isothermal-amplification-allows-testing-to-be-performed-anywhere