Группа исследователей разработала многообещающее решение проблемы CRISPR-Cas9 с нежелательными генетическими изменениями, используя метод, который позволяет им отключать редактирование генов до тех пор, пока оно не достигнет ключевых фаз клеточного цикла, на которых может произойти более точное восстановление.

Исследователи из Хиросимского университета и Токийского медицинского и стоматологического университета опубликовали в журнале «Биология связи» результаты своего исследования, которое успешно продемонстрировало более точное редактирование генов и подавление непреднамеренных генетических делеций, вставок или мутаций, называемых эффектами нецелевого действия. Хотя предыдущие методы были разработаны, сообщая о меньшем количестве нецелевых эффектов, связанных с технологией CRISPR, исследователи заявили, что они часто демонстрировали более низкую эффективность редактирования.

Мы стремились разработать метод, позволяющий избежать побочного эффекта, называемого эффектом отклонения от цели, который является одной из самых сложных проблем в области редактирования генома ».

Ватару Номура, один из авторов исследования, профессор Высшей школы биомедицинских и медицинских наук HU

«Наш метод подобен поражению двух зайцев одним выстрелом. Мы можем повысить точность редактирования генома и одновременно подавить нецелевые эффекты»

Больше контроля при редактировании генов

CRISPR-Cas9 открыл новые горизонты в редактировании генов как более простой и менее дорогой инструмент. Действуя как ножницы, он может отрезать генетический материал, который вы хотите изменить. Однако этот процесс может также создавать нецелевые эффекты, ограничивающие его использование в области терапии.

Новейший метод, разработанный для устранения нецелевых эффектов, работает с использованием анти-CRISPR белка AcrIIA4, который работает как «выключатель», который останавливает активность SpyCas9 по редактированию генома. Исследователи объединили AcrIIA4 с N-концевой областью человеческого Cdt1 – гена, который помогает гарантировать, что репликация ДНК происходит только один раз за деление клетки, – намереваясь деактивировать редактирование гена до тех пор, пока S и G ₂ не станут фазами клеточного цикла, когда гомологически направленная репарация (HDR) является доминирующей.

HDR – это один из двух процессов репарации ДНК, используемых организмами наряду с негомологичным соединением концов (NHEJ). Однако из двух методов HDR является предпочтительным, поскольку восстановление зависит от наличия двух копий хромосом в каждой клетке. Использование HDR дублированной хромосомы в качестве шаблона для восстановления делает редактирование генов более точным, в отличие от NHEJ, который просто стремится соединить разорванные концы ДНК. HDR происходит во время фаз S и G ₂ клеточного цикла, в то время как NHEJ работает во всех фазах, особенно в G ₁ – первой фазе межфазной стадии цикла, когда клетка растет в подготовка к репликации ДНК.

Исследователи обнаружили, что количество слияния ArIIA4-Cdt1 зависит от клеточного цикла. Он увеличивается во время фазы G ₁ которая останавливает редактирование генов и, следовательно, останавливает восстановление через NHEJ. Между тем, оно уменьшается во время следующих фаз S, G ₂ и M.

«Эффективность HDR с использованием AcrIIA4-Cdt1 была увеличена примерно в 4,0 раза по сравнению с использованием одного SpyCas9. В целевом или нецелевом сайте 1 (ген HCN1) коэффициент мутаций снизился на 86,5%. коэффициент мутаций в нецелевом сайте 2 (ген MFAP1) был снижен с 8,5% до 0,6% с использованием AcrIIA4-Cdt1 », – сказали исследователи в своем исследовании.

«Совместная экспрессия SpyCas9 и AcrIIA4-Cdt1 не только увеличивает частоту HDR, но и подавляет нецелевые эффекты. Таким образом, комбинация SpyCas9 и AcrIIA4-Cdt1 является зависимой от клеточного цикла системой активации Cas9 для точной и эффективное редактирование генома ".

Номура сказал, что они хотят еще больше повысить точность системы, чтобы ее можно было безопасно использовать в терапевтической сфере. «Мы планируем применить нашу систему к другим комбинациям CRISPR / анти-CRISPR, а также к другим редакторам генов на основе CRISPR, таким как редакторы баз и целевые медиаторы транскрипции», – сказал он. «Наша конечная цель – разработать систему редактирования генома, которую можно было бы безопасно использовать в области медицинской терапии»