DTU-исследователи разрабатывают новый метод быстрого обнаружения РНК SARS-CoV-2, который также может быть разработан для обнаружения других заболеваний.

Современные методы обнаружения РНК SARS-CoV-2, рекомендованные Всемирной организацией здравоохранения, в значительной степени зависят от роли биологических ферментов. Высокая стоимость, строгие условия транспортировки и хранения, а также глобальная нехватка ферментов ограничивают масштабное тестирование. Это означает, что большинству стран приходится уделять первоочередное внимание тестированию уязвимых случаев, что задерживает диагностику и выявление положительных случаев, что опять же может препятствовать смягчению и подавлению пандемии.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (qRT-PCR) по-прежнему является золотым стандартом для полногеномного обнаружения и играет решающую роль в борьбе с пандемией Covid-19. Однако на приведение образца к результату уходит несколько часов. Для этого метода требуется сложный термоциклер для повышения и понижения температуры реакции дискретными шагами.

Проще и дешевле

Неферментативные изотермические методы амплификации, будучи более простыми и быстрыми, показали многообещающие возможности замены qRT-PCR. Хотя эти методы очень хорошо работают, когда целевой ген короткий, они еще не работают эффективно для обнаружения целых геномов (длинных ДНК или РНК-мишеней).

Во время пандемии COVID-19 только в зоне евро за первый квартал 2020 года произошло падение ВВП на 3,8% (Eurostat 2020). Таким образом, разработка недорогой методологии обнаружения патогенов будет очень полезной как для пациентов, так и для систем здравоохранения, стремящихся бороться с будущими пандемиями.

Адъюнкт-профессор Йи Сун и постдок Мохсен Мохаммадниаи из DTU Health Tech изобрели анализ с одним горшком, который они назвали NISDA (неферментативный анализ изотермического вытеснения и амплификации). Анализ предназначен для быстрого обнаружения РНК SARS-CoV-2 без необходимости этапа обратной транскрипции РНК методологии qRT-PCR. Это позволяет выполнять одноэтапную процедуру обнаружения. Пользователю нужно всего лишь добавить образец в одну пробирку, поместить ее в прибор и подождать 30 минут для получения результата.

Для проведения анализов при постоянной температуре не требуются ферменты, и они основаны на подходе смещения цепи, опосредованном пальцами ног (TMSD). TMSD – это безферментный молекулярный инструмент, из которого одна цепь ДНК или РНК (выходная) замещается другой цепью (входная), чтобы сформировать более стабильную дуплексную структуру.

Высокая точность и чувствительность

Анализ NISDA обнаружил очень низкую концентрацию РНК (10 копий / мкл) всего за 30 минут. В сотрудничестве с больницами Hvidovre и Bispebjerg исследовательская группа смогла провести клиническую валидацию анализа NISDA, представляющего 100% специфичность и 96,77% и 100% чувствительность при настройке в лаборатории и больнице, соответственно.

Мы использовали подход TMSD и сконструировали три ДНК-зонда. Один зонд заменил весь геном на короткую цепь ДНК. Два других зонда использовали замененную короткую ДНК для запуска каскадной реакции усиления сигнала флуоресценции. Прелесть теста NISDA в его простоте. Мы отказались от использования ферментов, чтобы снизить стоимость анализа и повысить его устойчивость при комнатной температуре »

И Сун, доцент

Экстрагированную РНК из образцов мазка из зева добавляют к реакционной смеси и инкубируют при 42 ° C в течение 30 минут в рабочем процессе анализа. Следующим шагом является измерение флуоресценции, и образцы со значительно более высокими сигналами флуоресценции, чем контрольные образцы (отрицательные), считаются положительными.

На пути к инструменту диагностики множественных заболеваний

«Непосредственное участие в улучшении здоровья людей – это высшая мечта биомедицинского исследователя. Мы считаем, что анализ NISDA дал нам прекрасный шанс достичь этой цели», – говорит постдокторантский исследователь Мохсен Мохаммадниаи.

«Следующим шагом является дальнейшая разработка анализа NISDA для обнаружения различных патогенов и разработка диагностического устройства в месте оказания медицинской помощи для диагностики множественных заболеваний. Еще одним преимуществом анализа NISDA является его способность быть спроектированным для коротких мишеней РНК, таких как в качестве микроРНК биомаркера рака. В настоящее время мы изучаем различные схемы коммерциализации анализа NISDA. Мы уверены, что анализ NISDA вскоре станет широко известным », – завершает доцент Йи Сун.