Группа ученых из США недавно разработала дуплексный молекулярный анализ с одной пробиркой для быстрого обнаружения вариантов коронавируса 2 (SARS-CoV-2) тяжелого острого респираторного синдрома, содержащих спайковые мутации E484K и N501Y. Определение вирусных вариантов в образцах из носоглотки занимает всего 2,5 часа. Подробное описание метода анализа в настоящее время доступно на сервере препринтов medRxiv *.

Справочная информация

SARS-CoV-2, возбудитель пандемии коронавирусной болезни 2019 (COVID-19), представляет собой оболочечный одноцепочечный вирус с положительной РНК с размером генома около 30 т.п.н. С момента своего появления в декабре 2019 года SARS-CoV-2 претерпел более 12000 мутаций в ответ на различные факторы отбора, включая противовирусную терапию и иммунные ответы хозяина. Исследования геномных изменений SARS-CoV-2 показали, что большинство этих мутаций происходит в области, кодирующей спайк, что впоследствии способствует независимой эволюции вируса в несколько геномных вариантов. Некоторые из недавно появившихся вариантов SARS-CoV-2, включая варианты B.1.1.7, B.1.351 и P.1, были обозначены как варианты, вызывающие озабоченность (VOC), из-за их повышенной передаваемости и способности уклоняться. иммунные ответы хозяина.

На более поздней стадии пандемии COVID-19 две спайковые мутации, включая E484K и N501Y, привлекли значительное внимание из-за их способности увеличивать взаимодействие между спайк-ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ACE2) и снижать эффективность нейтрализующих антител SARS-CoV-2. Варианты SARS-CoV-2, содержащие эти мутации, в настоящее время циркулируют как преобладающие вирусные штаммы во многих странах, включая Великобританию, Южную Африку, Бразилию и США.

В текущем исследовании ученые разработали анализ генотипирования для быстрого выявления сигнатурных мутаций в различных вариантах SARS-CoV-2. Они использовали этот анализ для скрининга образцов из носоглотки, взятых у пациентов с COVID-19.

Дуплексный молекулярный анализ в одной пробирке

Чтобы идентифицировать сигнатурные мутации посредством генотипирования, ученые использовали зонды гибридизации олигонуклеотидов, также известные как зонды молекулярных маяков. Чтобы создать одноцепочечные ДНК-мишени для зондов, они провели асимметричную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для амплификации области гена шипа, покрывающей 484 и 502 кодона. В анализе они использовали два дифференциально меченых зонда для одновременного генотипирования в обеих геномных областях. Исходя из конструкции зонда, ожидается, что последовательность дикого типа будет давать более высокую температуру плавления по сравнению с таковой мутированной последовательности.

Используя этот анализ, они успешно генотипировали вирусные последовательности, выделенные из различных вариантов SARS-CoV-2, включая один штамм дикого типа, два варианта B.1.1.7, два варианта B.1.351 и один недавно появившийся вариант, содержащий мутацию E484K.

Кроме того, чтобы идентифицировать характерные мутации в образцах, полученных от пациентов, они провели анализ генотипирования с использованием инактивированных нагреванием, SARS-CoV-2-положительных образцов носоглотки, собранных из 8 различных больниц. Результаты показали, что доля мутаций E484K и N501Y в образцах составляла 8,8% и 8% соответственно. Однако одновременного появления обеих мутаций не наблюдалось ни в одном из протестированных образцов. Интересно, что новая мутация N501T была идентифицирована в 11 образцах, которые продемонстрировали значительно отличающийся профиль плавления от мутации дикого типа и мутации N501Y.

При дальнейшем анализе ученые наблюдали резкое увеличение мутации E484K в образцах, собранных в феврале 2021 года, в то время как ни один из образцов, взятых в декабре 2020 года, не обнаружил эту мутацию. Аналогичную тенденцию они наблюдали и для мутации N501Y.

Для дальнейшей валидации анализа генотипирования ученые провели анализ секвенирования всего генома с использованием панели из 74 образцов, содержащих различные генотипы, идентифицированные с помощью текущего анализа генотипирования. Анализ показал 100% однородность между результатами секвенирования всего генома и текущими результатами скрининга.

Значение исследования

В исследовании описывается разработка и проверка нового метода генотипирования, который является высокочувствительным для выявления сигнатурных мутаций, обнаруженных во вновь появившихся вариантах SARS-CoV-2. Кроме того, анализ способен идентифицировать новые мутации, которые присутствуют в областях связывания зонда.

Обычно для выявления мутаций в вирусных вариантах проводят анализ последовательности всего генома. Однако этот метод требует много времени и требует сложных процессов анализа данных. Благодаря быстрому изменению времени (всего 2,5 часа) новый анализ генотипирования обеспечивает высокопроизводительную платформу скрининга для быстрой идентификации вновь возникающих мутаций SARS-CoV-2.

* Важное примечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не проходят рецензирование и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие в клинической практике / поведении, связанном со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.