Проверено Эмили Хендерсон, бакалавр наук 21 октября 2020 г.

Редактирование генов для разработки новых методов лечения, а также для изучения болезней, а также нормального функционирования человека и других организмов, может продвигаться быстрее с новым инструментом для вырезания больших фрагментов ДНК из генома клетки, согласно новое исследование ученых Калифорнийского университета в Сан-Франциско.

Публикация исследования UCSF 19 октября 2020 года в журнале Nature Methods произошла менее чем через две недели после того, как два исследователя, впервые применившие генетические ножницы, известные как CRISPR-Cas9, были отобраны для получения награды в этом году Нобелевская премия по химии.

Хотя сейчас CRISPR используется в качестве исследовательского инструмента в лабораториях по всему миру, он несколько лет назад эволюционировал в бактериях как средство борьбы со своими древними врагами, целым рядом вирусов, известных как бактериофаги.

Когда бактерии сталкиваются с фагом, они включают часть вирусной ДНК в свою собственную ДНК, которая затем служит шаблоном для создания РНК, которая связывается с соответствующей вирусной ДНК в самом фаге. Затем ферменты CRISPR нацелены, отключают и убивают фаг.

В своей последней работе, посвященной изучению этой древней и странной гонки вооружений, главный исследователь Джозеф Бонди-Деноми, доктор философии, доцент кафедры микробиологии и иммунологии UCSF, присоединился к ученым Балинту Чорге, доктору философии, и Лине Леон для разработки и тестирования новый инструмент CRISPR.

Уже известный ансамбль CRISPR-Cas9 похож на молекулярное долото, которое можно использовать для быстрого и точного вырезания небольшого фрагмента ДНК на целевом участке.

Затем можно использовать другие методы для вставки новой ДНК. Но новая система CRISPR-Cas3, адаптированная учеными UCSF, использует другую бактериальную иммунную систему. Ключевой фермент в этой системе, Cas3, действует как молекулярный измельчитель древесины, быстро и точно удаляя гораздо более длинные участки ДНК.

Cas3 подобен Cas9 с двигателем – после нахождения своей конкретной ДНК-мишени он работает с ДНК и пережевывает ее, как Pac-Man ».

Джозеф Бонди-Деноми, доктор философии, главный исследователь и доцент кафедры микробиологии и иммунологии Калифорнийского университета в Сан-Франциско

Эта новая возможность удалять или заменять длинные участки ДНК позволит исследователям более эффективно оценивать важность участков генома, которые содержат последовательности ДНК неопределенной функции, согласно Bondy-Denomy, что является важным фактором для понимания человека и патогенов, которые преследовать их.

«Раньше не было простого и надежного способа удалить очень большие участки ДНК у бактерий для исследовательских или терапевтических целей», – сказал он. «Теперь, вместо того, чтобы делать 100 различных небольших делеций ДНК, мы можем просто сделать одну делецию и спросить:« Что изменилось? »»

Поскольку бактерии и другие типы клеток обычно используются для производства низкомолекулярных или белковых фармацевтических препаратов, CRISPR-Cas3 позволит ученым-биотехнологам более легко удалять потенциально патогенную или бесполезную ДНК из этих клеток, согласно Bondy-Denomy.

«Большие участки бактериальной ДНК плохо изучены, с неизвестными функциями, которые в некоторых случаях не являются необходимыми для выживания», – сказал Бонди-Деноми. «Кроме того, бактериальная ДНК содержит большие участки ДНК, импортированной из других источников, которые могут вызывать заболевание у человека-хозяина бактерии или нарушать метаболизм бактерий»

CRISPR-Cas3 также должен позволить встраивать целые гены в геном в промышленных, сельскохозяйственных или даже человеческих применениях генной терапии, сказал Бонди-Деноми.

Исследователи UCSF выбрали и модифицировали систему CRISPR-Cas3, используемую бактерией Pseudomonas aeruginosa, и продемонстрировали на этом и трех других видах, включая бактерии, вызывающие болезни у людей и растений, что их более компактная версия хорошо справляется с удалением отобранная ДНК всех четырех видов.

Другие системы CRISPR-Cas3 были созданы для работы в клетках человека и других млекопитающих, и это также должно быть достижимо для модифицированной системы P. aeruginosa, сказал Бонди-Деноми.

Bondy-Denomy изучает ряд бактерий, бактериофагов и систем CRISPR, чтобы больше узнать о том, как они работают, и найти полезные молекулярные инструменты.

«CRISPR-Cas3 – безусловно, самая распространенная система CRISPR в природе», – сказал он. «Примерно в 10 раз больше видов бактерий используют систему Cas3, чем систему Cas9. Возможно, Cas3 является лучшей бактериальной иммунной системой, потому что она измельчает ДНК фага»

В отличие от Cas9, когда Cas3 связывается со своей точной ДНК-мишенью, он начинает пережевывать одну цепь двухцепочечной ДНК в обоих направлениях, оставляя открытыми одну цепь.

Делеции, полученные в экспериментах UCSF, варьировались по размеру, во многих случаях охватывая до 100 бактериальных генов. Исследователи обнаружили, что механизм CRISPR-Cas3 также должен позволить упростить замену удаленной ДНК новой последовательностью ДНК.

Для удаления и редактирования ДНК в лаборатории ученые программируют системы CRISPR для нацеливания на конкретную ДНК в геноме интересующего организма, используя любую выбранную ими направляющую последовательность.

В новом исследовании CRISPR-Cas3, манипулируя последовательностями ДНК, предоставленными бактериям для восстановления делеций, исследователи смогли точно установить границы этих крупных восстановлений ДНК, чего они не смогли достичь с помощью CRISPR- Cas9.

Бонди-Деноми ранее обнаружил стратегии борьбы с CRISPR, которые фаг развил для борьбы с бактериями, и они могут оказаться полезными для остановки реакций редактирования генов, вызываемых ферментами Cas, используемыми в качестве терапевтических средств для человека, до появления побочных эффектов или в использовании фага для по его словам, удалить нежелательные бактерии, заселившие кишечник.

За исключением E. coli и пары других видов, относительно мало известно о 1000 или около того видах бактерий, которые обычно там обитают.

«Немодельные микробы в значительной степени остались позади в мире генетики, и существует огромная потребность в новых инструментах для их изучения», – сказал он.

Source link