Существует огромная потребность в создании различных типов клеток для использования в новых методах лечения для замены тканей, утраченных из-за болезни или травм, или для исследований вне человеческого тела, чтобы улучшить наше понимание того, как органы и ткани функционируют в состоянии здоровья. и болезнь. Многие из этих усилий начинаются с индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые теоретически способны дифференцироваться практически в любой тип клеток в правильных условиях культивирования.

Нобелевская премия 2012 года, присужденная Шинья Яманака, признала его открытие стратегии, которая может репрограммировать взрослые клетки в ИПСК, предоставляя им определенный набор ген-регуляторных факторов транскрипции (ТФ). Однако продвижение оттуда к эффективному созданию широкого диапазона типов клеток с тканеспецифическими дифференцированными функциями для биомедицинских приложений остается проблемой.

В то время как экспрессия TF, специфичных для определенного типа клеток, в ИПСК является наиболее часто используемой технологией клеточной конверсии, эффективность проведения ИПСК через различные «стадии клонирования» до полностью функционального дифференцированного состояния, например, конкретного сердца, мозга , или количество иммунных клеток в настоящее время низкое, главным образом потому, что наиболее эффективные комбинации ТФ не могут быть легко определены. TF, которые инструктируют клетки пройти через определенный процесс дифференцировки клеток, связываются с регуляторными областями генов, чтобы контролировать их экспрессию в геноме. Однако множественные TF должны функционировать в контексте более крупных сетей регуляции генов (GRN), чтобы управлять развитием клеток через их клоны до тех пор, пока не будет достигнуто окончательное дифференцированное состояние.

Теперь совместные усилия под руководством Джорджа Черча, доктора философии. из Гарвардского института биологической инженерии Висса и Гарвардской медицинской школы (HMS), а также Антонио дель Соль, доктор философии, который возглавляет группы вычислительной биологии в CIC bioGUNE, члене Баскского исследовательского и технологического альянса, в Испании и Люксембургский центр системной биомедицины (LCSB, Университет Люксембурга) разработал инструмент компьютерного проектирования под названием IRENE, который значительно помогает повысить эффективность конверсии клеток за счет прогнозирования высокоэффективных комбинаций ТФ, специфичных для определенного типа клеток.

Объединив IRENE с системой геномной интеграции, которая обеспечивает устойчивую экспрессию выбранных TF в iPSC, команда продемонстрировала свой подход к созданию большего количества естественных клеток-киллеров, используемых в иммунотерапии, и меланоцитов, используемых в кожных трансплантатах, чем при использовании других методов. Впервые в науке были созданы эпителиальные клетки молочной железы, доступность которых была бы очень желательна для репопуляции хирургически удаленной ткани молочной железы. Исследование опубликовано в Nature Communications.

«В нашей группе исследование естественным образом основывалось на проекте« TFome », который собрал обширную библиотеку, содержащую 1564 TF человека, в качестве мощного ресурса для идентификации комбинаций TF с расширенными возможностями репрограммирования ИПСК человека на различные типы клеток-мишеней. , – сказала Чёрч, член факультета Висс. «Эффективность этого вычислительного алгоритма повысит эффективность наших усилий по тканевой инженерии в Институте Висса и HMS, и как открытый ресурс может сделать то же самое для многих исследователей в этой развивающейся области». Черч является руководителем платформы синтетической биологии Института Висса и профессором генетики в HMS и медицинских наук и технологий в Гарварде и Массачусетском технологическом институте

Оснастка

Было разработано несколько вычислительных инструментов для прогнозирования комбинаций TF для конкретных клеточных превращений, но почти исключительно они основаны на анализе паттернов экспрессии генов во многих типах клеток. В этих подходах отсутствовал взгляд на эпигенетический ландшафт, организацию самого генома вокруг генов и в масштабе целых участков хромосомы, который выходит далеко за рамки последовательности голой геномной ДНК.

«Изменение эпигенетического ландшафта в дифференцирующихся клетках предсказывает, что области в геноме претерпевают физические изменения, которые имеют решающее значение для ключевых ТФ, чтобы получить доступ к своим генам-мишеням. Анализ этих изменений может дать более точную информацию о GRN и их участвующих TF, которые управляют конкретными клетками конверсии ", – сказал соавтор исследования Эван Эпплтон, доктор философии. Эпплтон – научный сотрудник группы Чёрча, которая объединила усилия с Сашей Юнгом, доктором философии, из группы дель Соль в новом исследовании. «Наши сотрудники в Испании разработали вычислительный подход, который объединил эти эпигенетические изменения с изменениями в экспрессии генов, чтобы получить критические комбинации TF в качестве результата, который мы были в идеальном положении для тестирования»

Команда использовала свой вычислительный подход «Интегративная модель регуляторной сети генов» (IRENE) для реконструкции GRN, контролирующих ИПСК, а затем сосредоточилась на трех типах клеток-мишеней, имеющих клиническое значение, для экспериментальной проверки комбинаций ТФ, приоритетных для IRENE. Для доставки комбинаций TF в ИПСК они развернули систему геномной интеграции на основе транспозонов, которая может интегрировать в геном несколько копий гена, кодирующего TF, что позволяет стабильно экспрессировать все факторы комбинации. Транспозоны – это элементы ДНК, которые могут перескакивать из одной позиции генома в другую или, в данном случае, из экзогенно предоставленной части ДНК в геном.

«Наша исследовательская группа, состоящая из ученых из LCSB и CIC bioGUNE, имеет многолетний опыт в разработке вычислительных методов для облегчения преобразования клеток. IRENE – это дополнительный ресурс в нашем наборе инструментов, и экспериментальная проверка показала, что он значительно расширился. эффективность в большинстве проверенных случаев », – пишет автор-корреспондент Дель Соль, профессор LCSB и CIC bioGUNE. «Наши фундаментальные исследования в конечном итоге должны принести пользу пациентам, и мы очень рады, что IRENE может увеличить производство источников клеток, которые можно легко использовать в терапевтических целях, таких как трансплантация клеток и генная терапия»

.

Проверка компьютерного инструмента проектирования в ячейках

Исследователи выбрали эпителиальные клетки молочной железы человека (HMEC) в качестве первого типа клеток. До сих пор HMEC были получены из одной тканевой среды, диссоциированы и трансплантированы в ту, где ткань груди была резецирована. HMEC, генерируемые из клеток пациентов на промежуточной стадии iPSC, могут обеспечить средства для менее инвазивной и более эффективной регенерации ткани груди. Одна из комбинаций, созданных IRENE, позволила команде преобразовать 14% ИПСК в дифференцированные HMEC в культуральных средах, специфичных для ИПСК, показывая, что предоставленных TF было достаточно для стимулирования конверсии без помощи дополнительных факторов.

Затем группа обратила свое внимание на меланоциты, которые могут служить источником клеток в клеточных трансплантатах для замены поврежденной кожи. На этот раз они выполнили преобразование клеток в целевой среде для меланоцитов, чтобы показать, что выбранные ТФ работают в условиях культивирования, оптимизированных для желаемого типа клеток. Две из четырех комбинаций смогли повысить эффективность конверсии меланоцитов на 900% по сравнению с ИПСК, выращенными в целевой среде без ТФ. Наконец, исследователи сравнили комбинации ТФ, приоритетные для IRENE для генерации естественных клеток-киллеров (NK), с современным методом дифференцировки, основанным только на условиях культивирования клеток. Было обнаружено, что иммунные NK-клетки улучшают лечение лейкемии. Подход исследователей превзошел стандарт: пять из восьми комбинаций увеличили дифференцировку NK-клеток с критическими маркерами на 250%.

«Этот новый вычислительный подход может значительно облегчить ряд работ по клеточной и тканевой инженерии в Институте Висса и во многих других учреждениях по всему миру. Этот прогресс должен значительно расширить наш инструментарий, поскольку мы стремимся разработать новые подходы в регенеративной медицине для улучшения жизни пациентов ", – сказал директор-основатель Wyss Дональд Ингбер, доктор медицины, доктор философии, который также является профессором сосудистой биологии Джуды Фолкман в HMS и Бостонской детской больнице и профессором биоинженерии в Гарвардской школе инженерии Джона А. Полсона. и прикладные науки.