Группа исследователей из Швейцарского федерального технологического института разработала высокопроизводительный сканирующий микроскоп ионной проводимости (SICM), используя последние достижения в области нанопозиционирования, изготовления нанопор, микроэлектроники и техники управления.

Сканирование с временным разрешением позволяет трехмерную визуализацию динамических структур в мембране эукариотической клетки с нанометровым разрешением.

Изучение функций живых клеток и органелл на наноуровне жизненно важно для понимания причин болезней. К сожалению, традиционные подходы, включая электронную микроскопию, могут повредить эти клетки.

Швейцарские исследователи разработали микроскоп SCIM, который разрешает пространственно-временные трехмерные процессы на мембране эукариотической клетки с осевым разрешением менее 5 нанометров. Это может дать представление о внутриклеточных взаимодействиях в борьбе с инфекциями и болезнями.

Истоки сканирующей зондовой микроскопии

Изучение сложных функций живых клеток в наномасштабе является уникальной задачей. Исследователи разработали ряд методов для решения этой задачи, включая атомно-силовую микроскопию (АСМ), сканирующую туннельную микроскопию (СТМ) и сканирующую зондовую электрохимию (SPE).

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) формирует изображения поверхностей с помощью зонда, который сканирует образец. Впервые этот метод появился в 1981 году в виде сканирующего туннельного микроскопа, который создает изображения с атомным разрешением путем сканирования образца с помощью зонда.

В сканирующих зондовых микроскопах пьезоэлектрические приводы перемещают зонд с точностью до атомного уровня, управляемой электроникой. Растр зонда сканирует образец. Он фиксирует дискретные точки данных, которые используются для формирования изображения. Его способ сканирования называется режимом.

Сканирующая ионно-проводящая микроскопия (SICM) была разработана P.K. Хансма и его коллеги из Калифорнийского университета в 1989 г. Водная среда, содержащая электролит, является плохим проводником.

Микроскоп SCIM сканирует нанозонд (микропипетка с отверстием от 50 до 100 нм) вблизи поверхности образца. Когда зонд перемещается по образцу, через пипетку протекают ионные токи. Сила этих токов меняется в зависимости от электрического сопротивления на поверхности образца, что позволяет получить информацию о его составе.

Однако в режиме скачкообразной перестройки, описанном швейцарской командой, нанозонд не сканируется в растре. Он прыгает вертикально вверх и вниз.

Зонд приближается к образцу на расстоянии от 25 до 50 нм в определенных точках и втягивается, обеспечивая тем самым дискретные точки измерения, из которых формируется изображение. Важно отметить, что зонд никогда не касается образца, что предотвращает повреждение образца.

SCIM-микроскопия, таким образом, является мощным инструментом для фиксации резких изменений топографии клетки без воздействия на образец.

Сканирующая ионная проводимость с временным разрешением

Микроскопы SICM с временным разрешением позволяют получать с высоким разрешением профили форм клеток и характеристик поверхности. Однако их необходимо соотносить с биохимической информацией и изменениями внутренней организации клеток.

Швейцарская группа интегрировала инвертированный оптический микроскоп в микроскоп SICM, что позволило им объединить недавно разработанные методы микроскопии сверхвысокого разрешения в своем подходе.

Установка SICM состояла из специально изготовленного Z-привода пипетки (вертикального привода), интегрированного в устройство с контролируемой атмосферой, критически важное для жизнеспособности клеток во время визуализации.

Визуализация эукариотических клеток требует пьезоактуаторов с большим радиусом действия (> 10-20 мкм). Это приводит к компромиссу между резонансной частотой и диапазоном привода. Команда преодолела это, адаптивно снизив скорость пипетки и применив усиление к пьезодвижению в зависимости от текущей кривой взаимодействия.

Z-актуатор обеспечивает широкое усиление механического смещения в диапазоне сканирования 22 мкм на поверхности ячейки. Он управлялся изготовленным на заказ пьезоконтроллером и интегрирован со ступенью шагового двигателя для приближения к образцу.

Команда использовала боросиликатные и кварцевые нанопипетки для исследования. Они были изготовлены с помощью лазерного съемника CO ₂ с радиусом от 20 до 60 нм. Кварцевые капилляры были уменьшены до радиуса менее 10 нм с помощью облучения электронным пучком.

Многие клеточные процессы происходят в масштабе минут или часов и легко отслеживаются с помощью покадровой SICM. Однако субклеточные процессы, такие как эндоцитоз или инфекция, происходят намного быстрее. Методика швейцарской группы сочетает в себе возможность относительно быстро обрабатывать большие объемы изображений (до 220 000 мкм ³ ) с высокоскоростной визуализацией SICM мелких деталей на живых клетках.

Возможен широкий диапазон измерений (размеры сканирования от 500 × 500 нм ² до 100 × 100 мкм ² скорость получения изображений от 0,5 с / изображение до 20 мин / изображение; Количество пикселей на изображение от 1 кп до 1 Мп; глубина обзора 22 мкм с осевым разрешением ниже 10 нм) значительно расширяет диапазон биологических исследований, облегчаемых микроскопией SICM.

Ссылки и дополнительная литература

Лейтао, С. и др., (2021) Сканирующая микроскопия ионной проводимости с временным разрешением для трехмерного отслеживания динамики клеточной поверхности в наномасштабе. ACS Nano [online] Доступно по адресу: https://doi.org/10.1021/acsnano.1c05202

Лю Б. и др. (2013) Сканирующая микроскопия ионной проводимости: нанотехнология для биологических исследований живых клеток. Границы физиологии [online] 3. Доступно по адресу: https://doi.org/10.3389/fphys.2012.00483

Отказ от ответственности: мнения, выраженные здесь, принадлежат автору, выраженному в их личном качестве, и не обязательно отражают точку зрения AZoM.com Limited T / A AZoNetwork, владельца и оператора этого веб-сайта. Этот отказ от ответственности является частью Условий использования этого веб-сайта.