Исследователи продолжают добиваться лучшего понимания тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2), вируса, стоящего за продолжающейся пандемией коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19). Об одной такой попытке было сообщено в новом препринте на сервере bioRxiv * посвященном феномену обратного отслеживания.

Отслеживание вирусной репликации

Обратное отслеживание относится к ретроградному движению РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp), которая является ключевым ферментом в комплексе репликации-транскрипции SARS-CoV-2. Этот фермент состоит из трех вирусных неструктурных белков sp7 / nsp82 / nsp12 и требует многих других кофакторов для выполнения своей функции. К ним относятся геликаза nsp13 и узел корректуры nsp10 / nsp14.

Обратное отслеживание важно для регуляции транскрипции через молекулы DdRp. DdRp и аппарат транскрипции связаны с движением ДНК назад, но транскрипт РНК прокладывает себе путь назад через комплекс. Это приводит к одноцепочечному транскрипту 3 ’РНК, который выталкивается через вторичный выход, называемый входным туннелем нуклеозид-трифосфат (NTP).

Цели исследования

Настоящее исследование пытается решить загадку, созданную предполагаемым структурным расположением геликазы nsp13, связанной с репликационно-транскрипционным комплексом (RTC) вируса. Это включает в себя как nsp13, так и RdRp, претерпевающие транслокацию на цепи РНК в противоположных направлениях, первый в направлении 5 '-> 3', а второй в направлении 3 '-> 5' на одной и той же цепи матричной РНК.

Если геликаза nsp 13 преуспеет, она оттолкнет RdRp обратимым скользящим движением назад. Об этом обратном прослеживании ранее сообщалось в клеточных ДНК-зависимых РНК-полимеразах.

Исследователи предположили, что транслокация геликазы опосредует возврат RdRp в репликацию SARS-CoV-2, что делает ее энергетически выгодной. Этот процесс позволил бы проводить корректуру РНК и переключение матрицы во время транскрипции субгеномной РНК.

Nsp 13 связывает цепь матричной РНК

Они сконструировали РНК-каркасы на основе оригинального RTC-каркаса SARS-CoV-2 для тестирования комплексов с обратным отслеживанием RdRp (BTC). Они обнаружили, что holo-RdRp связывается с каркасом RTC, но не может эффективно связываться с каркасом BTC без nsp13.

Однако в присутствии nsp13 образуются стабильные комплексы. Используя крио-ЭМ, они исследовали сборку nsp 13-RdRp-BTC и обнаружили два основных отклонения от структур nsp 13-RTC. Во-первых, был обнаружен комплекс матрица-РНК-nsp 13, а во-вторых, одноцепочечный 3 ’сегмент p-РНК был экструдирован во вторичный входной туннель NTP.

Взаимодействие одноцепочечного 5'-сегмента т-РНК с nsp 13 происходило в семинуклеотидном участке от +14 до +8. Участок из пяти нуклеотидов беспорядочно связывает т-РНК между задействованным nsp 13 и RdRp.

РНК с обратным прослеживанием, экструдированная в входной туннель NTP

Обнаружение выдавленного сегмента в туннеле входа NTP RdRp подтвердило присутствие BTC, который сильно аналогичен BTC DdRp.

Исследователи ранее выяснили архитектуру расщелины активного сайта DdRp, которая была разделена на канал для цепи ДНК-матрицы и туннель для входа NTP. Один из них проходил выше, а другой ниже спирали моста DdRp.

Подобно мостовой спирали, мотив F вирусного RdRp разделяет две цепи РНК BTC. Наличие этого входного туннеля обеспечивает энергетически благоприятную среду без стерических препятствий. Это позволяет РНК, прошедшей обратный путь, покинуть активный сайт, избегая при этом обструктивных полярных взаимодействий между РНК и белком.

Этот туннель имеет электростатическую поверхность, содержащую положительно заряженные остатки аргинина и лизина на мотиве F, дополненные консервативными остатками мотивов RdRp C и E.

Nsp 13 способствует возврату

Holo-RdRp SARS-CoV-2 дикого типа требует геликазы nsp13 для эффективного связывания с каркасами BTC. Это не относится к голо-RdRp, содержащему nsp12, замещенному на D760A.

Nsp12-D760 представляет собой остаток в мотиве C RdRp, который удаляет важный ион магния из каталитического комплекса. Однако магний отсутствует во всех структурах RdRp без подложки, таких как BTC в данном случае.

Удаление D760 стабилизирует связывание BTC с каркасами. Это связано с тем, что исходная аминокислота предотвращает отслеживание фосфатного остова РНК с обратным отслеживанием без ионов магния, согласно структурам BTC, предложенным в текущем исследовании.

Альтернативно, для преодоления этого энергетического барьера требуется геликаза nsp 13. Они обнаружили, что наиболее высока вероятность посттранслокационного состояния для RTC с остатком 4-тио-U, изолированным в гибриде РНК-РНК. Хотя это делает его недоступным для сшивания с nsp12, добавление nsp 13 заметно увеличивает сшивание.

Неправильная инкорпорация способствует обратному отслеживанию

Более того, исследование также показывает, что если несовпадающий нуклеотид добавляется к растущей цепи р-РНК на 3'-конце, он подвергается спонтанному изнашиванию, чтобы попасть в туннель входа RdRp NTP примерно в 60% случаев, тогда как согласованный нуклеотид провел 100% времени в кармане активного каталитического сайта.

Эти данные указывают на существование вторичного туннеля для включения РНК с обратным отслеживанием, что важно для проверки во время синтеза РНК, чтобы гарантировать точность транскрипции. Это аналог клеточного DdRps, хотя и не связан с ними эволюционно, что указывает на то, что эта особенность важна для ферментов транскрипции.

Несоответствующие нуклеотиды потратили более 50% своего времени на истирание из цепи-матрицы, либо внутри, либо по направлению к туннелю входа NTP, что, вероятно, предотвращает дальнейшую транслокацию и удлинение цепи. Этому также способствуют электростатические и стерические условия входного туннеля NTP, которые способствуют обратному прослеживанию.

Поскольку транслокация предотвращена, геликаза nsp 13 может прочно связываться с одноцепочечной т-РНК, что облегчает опосредованное геликазой обратное прослеживание комплекса за счет своей 5 '-> 3' транслокационной активности.

Каковы последствия?

Таким образом, исследование подтверждает важное предсказание существующей модели субгеномной транскрипции и корректуры, основанной на переключении шаблона. Способность SARS-CoV-2 возвращаться назад доказывает, что переключение шаблонов может происходить посредством этого процесса.

Во-вторых, включение противовирусных препаратов, таких как ремдесивир, то есть аналогов нуклеотидов, которые включаются в продукты РНК с помощью RdRps, может привести к обратному отслеживанию. Неправильное включение останавливает активность RdRp, так что nsp13 взаимодействует с нитью матрицы ниже по течению и запускает обратное отслеживание.

Экструзия 3'-конца р-РНК из входного туннеля NTP позволила бы вирусным компонентам корректуры разложить его и таким образом удалить несовпадающий нуклеотид. Эта активность является ключом к устойчивости коронавирусов к противовирусным препаратам с множественными нуклеотидными аналогами.

Понимание обратного отслеживания RdRp и его потенциальной роли в корректуре CoV может облегчить разработку терапевтических средств ».

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.