Поскольку пандемия коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19) продолжает уносить человеческие жизни и экономическую активность, появляются сообщения о повторных положительных тестах и ​​продолжающемся выделении вируса в течение недель и месяцев после клинического выздоровления.

Исследование, опубликованное в качестве препринта на сервере bioRxiv * в декабре 2020 года, показывает, что геном коронавируса-2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) вставлен в геном человека, учет вирусных РНК даже в позднем периоде выздоровления.

<img alt=" Диаграмма рассеяния, показывающая химерное число считывания человеческого CoV2 "height =" 943 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2020/12/Capture14.jpg "title =" Диаграмма рассеяния, показывающая число считывания химерного CoV2 человека "width =" 2006 "/> ]

Диаграмма рассеяния, показывающая число считывания химерного CoV2 человека. Изображение предоставлено: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.12.12.422516v1.full.pdf[19459005impression[19459016provided

)

Реинфекция или обратная транскрипция?

За последний год было зарегистрировано множество случаев очевидного повторного заражения. Хотя некоторые из них были тщательно исследованы и признаны подлинными случаями повторного заражения, о чем свидетельствует присутствие разных штаммов SARS-CoV-2 в двух эпизодах, маловероятно, что это так в большинстве случаев. Кроме того, не было выделено никакого репликационно-способного вируса.

В текущем исследовании изучалась возможность обратной транскрипции РНК SARS-CoV-2 в геном человека. Это привело бы к положительным результатам ПЦР из-за продолжающейся транскрипции вирусных РНК.

Активность обратной транскриптазы (RT) была обнаружена в клетках человека, а также интеграция продуктов обратной транскрипции. Например, для транскриптов APP их интеграция в нейрональные геномы с помощью эндогенной RT сопровождалась транскрипцией APP.

Такая эндогенная RT потенциально присутствует в форме элементов LINE-1 человека, которые составляют 17% генома человека. Это автономные элементы ретротранспозона, которые могут транспонировать себя, а также другие элементы генома обратно в ДНК ядра для будущей транскрипции.

Химерные риды присутствуют в опубликованных последовательностях РНК

Исследователи изучили опубликованные РНК-последовательности клеток, инфицированных SARS-CoV-2. Их целью было найти химерные транскрипты, объединяющие человеческую и вирусную РНК в один геном. Они обнаружили большое количество таких считываний в нескольких различных типах клеток, из сердца, мозга, легких и желудка, а также из клеток, полученных из жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ), полученной от пациентов с COVID-19.

Доля таких химерных последовательностей напрямую коррелировала с уровнем вирусной РНК в каждом образце, и такие считывания обычно составляли от 0,004% до 0,14% от общего количества считываний вирусов. Наибольшая доля была в клетках ЖБАЛ от пациентов с тяжелой формой COVID-19, ~ 69%. С другой стороны, в клетках крови их почти не было.

Большая часть химерного белка вируса-хозяина содержала последовательности нуклеокапсида (N), как и ожидалось, поскольку это самая распространенная субгеномная РНК вируса. Следовательно, наиболее вероятно, что это будет обратная расшифровка, а затем интегрирована. Эти данные подтверждают наличие этого события в инфицированных клетках.

Источники активности ОТ: LINE-1 или ВИЧ-1

Исследователи провели эксперимент по индукции сверхэкспрессии элементов LINE-1 человека или ОТ ВИЧ-1 в клеточной линии. Три исследованных типа ОТ включают: избыточную экспрессию LINE-1, управляемую промотором CMV, избыточную экспрессию LINE-1, управляемую 5 ’UTR, который является ее естественным промотором, и экспрессию RT ВИЧ-1.

Затем эти клетки инфицировали SARS-CoV-2. Через два дня после заражения они провели тесты полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения вирусных последовательностей, используя наборы праймеров для нацеливания на N, используемые в обычно используемых ПЦР-тестах на COVID-19.

ПЦР-амплификация очищенной клеточной ДНК из инфицированных клеток показала присутствие полос N-белка. Этого не происходило в нетрансфицированных или незараженных клетках. Затем они очистили клеточную геномную ДНК (гДНК) от клеток, которые сверхэкспрессируют ОТ, и провели количественную ПЦР (кПЦР) для подтверждения присутствия последовательностей N.

Сверхэкспрессия CMV-LINE-1 привела к 8-кратному увеличению силы сигнала N-последовательности. Это указывает на то, что в геном этих клеток было интегрировано большее количество N-последовательностей по сравнению с экспрессией 5 ’UTR-LINE-1 или экспрессией ОТ ВИЧ-1. Они смогли клонировать полноразмерную N ДНК из клеток, сверхэкспрессирующих первый тип RT, но не два других. Это может быть связано с меньшим числом N-последовательностей, интегрированных в геном хозяина.

Они также провели эксперимент RT in vitro, который показал, что клеточные лизаты из клеток, экспрессирующих RT любого типа, могут вызывать обратную транскрипцию очищенной вирусной РНК из инфицированных клеток.

N-последовательности, обнаруженные в ядре клетки

Используя технологию флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), они зафиксировали наличие и текущую транскрипцию вирусных N-последовательностей в ядре клетки с помощью N-нацеленных флуоресцентных зондов. Последовательности N были обнаружены в цитоплазме, как и ожидалось от клеток, инфицированных SARS-CoV-2.

Однако FISH также улавливал сигналы N РНК из ядра клеток, которые сверхэкспрессировали LINE-1, показывая, что интегрированные N-последовательности в геном хозяина транскрибируются там.

Это произошло примерно в 35% клеток с избыточной экспрессией LINE-1 по сравнению с 12% клеток, не экспрессирующих LINE-1 со сверхэкспрессией. Опять-таки, 30% инфицированных клеток, трансфицированных плазмидами LINE-1, показали ядерные N-сигналы FISH, но только 13% нетрансфицированных клеток. Примерно десятая часть инфицированных нетрансфицированных клеток показала ядерные N-сигналы, указывающие на эндогенную активность ОТ.

LINE-1 и цитокины опосредуют обратную транскрипцию

Исследователи обнаружили, что опубликованные данные о секвенировании РНК из клеток, инфицированных SARS-CoV-2, показали большое количество элементов LINE-1, которое напрямую коррелировало с количеством химерных считываний. В клеточной линии Calu-3, которая обеспечивает эффективное инфицирование, количество таких элементов активируется в три-четыре раза после заражения вирусом. ПЦР-тестирование показало, что эти клетки продемонстрировали RT-опосредованную интеграцию вирусного геномного материала в ДНК хозяина, возможно, за счет активации LINE-1 RT. Цитокины также могут активировать эндогенную экспрессию LINE-1 в два-три раза.

Последствия и будущие направления

Наши результаты показывают индуцированную экспрессию LINE-1 в клетках, подвергшихся стрессу вирусной инфекцией или подвергнутых воздействию цитокинов, что предполагает молекулярный механизм ретроинтеграции SARS-CoV-2 в человеческих клетках »

.

Интегрированные последовательности, вероятно, являются субгеномными и не могут продуцировать живые инфекционные вирионы. Это объясняет положительность более поздних ПЦР-тестов на вирусную РНК у клинически выздоровевших пациентов.

Потребуются дополнительные исследования, чтобы понять, приведет ли это к продолжающейся экспрессии вирусных антигенов, способных вызывать иммунный ответ. Также возможно, что присутствие вирусных элементов в геноме может усугубить вредные аспекты иммунного ответа, такие как гипервоспаление, опосредованное чрезмерным высвобождением цитокинов, или аутоиммунитет.

Авторы предполагают, что сайт вставки и регуляция эпигенетическими факторами, а также существующее иммунное состояние пациента могут влиять на трансляцию этих последовательностей и их возможные клинические последствия. Если ретроинтеграция действительно влияет на клиническую тяжесть и лечение COVID-19, то же самое может относиться и к другим вирусам, таким как вирус денге или Зика, или даже к вирусу гриппа.

Наконец, исследование предполагает, что многие положительные результаты ПЦР могут быть обусловлены вирусными транскриптами из таких химерных последовательностей, а не отражением присутствия реплицирующегося вируса в организме хозяина. Если это будет подтверждено, потребуются более качественные тесты, которые будут использоваться при оценке эффективности методов лечения COVID-19 в клинических испытаниях, например, в будущем.

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.