Поскольку коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) продолжает распространяться по всему миру и вызывать болезни и смерть в ужасающих масштабах, геномное секвенирование стало основным методом отслеживания возникающих вариантов и новых вспышек. В новом препринте medRxiv * исследуется роль секвенирования нанопор в этих усилиях.

Справочная информация

Технология секвенирования нанопор позволяет осуществлять глубокое секвенирование, будучи мобильным, доступным и масштабируемым. Кроме того, это не требует больших вложений в устройства или сети информационных технологий. Более того, его можно использовать для секвенирования любого типа генетического материала, либо рибонуклеиновой кислоты, либо дезоксирибонуклеиновой кислоты (РНК или ДНК, соответственно).

Таким образом, он позволяет упорядочивать сети, созданные на глобальном уровне. Это может позволить выявить вызывающие озабоченность варианты (ЛОС) на ранней стадии и более точно отслеживать, используя средства, доступные в небольших лабораториях на месте оказания медицинской помощи.

Эти варианты проблематичны именно потому, что они распространяются быстрее, более заразны или избегают иммунного ответа, и по любой или всем этим причинам они с меньшей вероятностью будут сдерживаться теми же действующими стратегиями. Поэтому их ранняя идентификация является насущной проблемой.

Даже помимо этого, поиск происхождения вируса продолжается, и геномные данные также будут очень полезны в этом поиске.

Как проводилось исследование?

Секвенирование нанопор было поэтому в центре внимания текущего исследования, направленного на внедрение его в диагностические системы, которые используются в повседневной жизни. Изменив его для повышения скорости и простоты, исследователи протестировали его на образцах, содержащих SARS-CoV-2, собранных на регулярной основе. Они также определили факторы, которые влияют на успех секвенирования до анализа.

Очистка РНК и ПЦР

Исследователи использовали протокол очистки РНК на основе магнитных шариков из остаточных диагностических образцов. Они обнаружили, что этот протокол, использующий прямой отбор образцов из остаточных образцов, был не только эффективным с точки зрения отбора образцов, но и позволял опустить некоторые шаги, что упростило рабочий процесс.

Они также определили, что полуколичественная или количественная ОТ-ПЦР может быть использована с мультиплексными пулами праймеров 1 и 2 для проведения обратной транскрипции РНК SARS-CoV-2 (+), а также для амплификации 1200 п.н. ампликоны.

Набор полуночных расщепленных праймеров из протокола ARTIC сначала был использован в двух мультиплексных прогонах ПЦР для амплификации кДНК SARS-CoV-2. Здесь каждая реакция ПЦР дает ампликоны размером 1200 п.н., которые расположены в последовательном порядке, обеспечивая мозаичный неперекрывающийся набор последовательностей. Затем две комплементарные смеси ампликонов объединяют, чтобы можно было секвенировать весь геном SARS-CoV-2.

Это показало, что интенсивность полосы сильно зависела от вирусной нагрузки, но также варьировалась в зависимости от пороговых значений цикла между двумя пулами. Этот подход, названный подходом «полуночного праймера», оказался успешным в праймировании процесса обратной транскрипции.

Подготовка и секвенирование библиотеки

Используя набор для быстрого штрих-кодирования (SQK-RBK004, Oxford Nanopore) для подготовки библиотеки, исследователи обнаружили, что они могут секвенировать продукты ПЦР немедленно, без предварительной очистки. Используя два отдельных устройства, они обнаружили, что подходящая глубина считывания около 10 Мбит / с на штрих-код может быть достигнута в разные моменты времени, в зависимости от вирусной нагрузки.

Кроме того, они секвенировали весь геном на устройстве MinION Mk1C (Oxford Nanopore) с использованием мультиплексированных пулов 1 и 2, достигнув полного глубокого покрытия (то есть не менее 10 мегабаз для каждого штрих-кода). Таким образом, все ампликоны размером 1200 п.н. были эффективно и специфично амплифицированы с помощью этой мультиплексной реакции ПЦР.

Объединение консенсусных последовательностей

Они использовали процесс слияния для решения неразрешенных областей в двух последовательностях, возвращаемых двумя разными алгоритмами. Эта «суперсогласованная» последовательность не только имела гораздо меньше неразрешенных областей, но и показывала высококачественные мутации, в то же время исключая ложноположительные по большей части.

Таким образом, программа слияния консенсуса полезна для достижения высококачественного вызова между вариантами, но подчеркивает, что последовательности, полученные из двух различных алгоритмов, используемых здесь, являются комплементарными в секвенировании нанопор. Обратной стороной является потеря информации о количестве чтений для каждого варианта и таких метаданных.

Единая полная высококачественная последовательность была достигнута с титром SARS-CoV-2 4x 10 ⁶ или выше. Это подтверждает теорию о том, что число копий ниже 4x 10 ⁶ указывает на неполные геномы. Другими словами, « мы приводим здесь убедительные доказательства того, что нормализованные по количеству копий значения CT диагностической RT-qPCR могут использоваться в качестве критерия успеха секвенирования ».

Выше этого порога образцы могли быть справедливо отнесены к разным кладам.

Каковы последствия?

Таким образом, исследователи смогли отшлифовать свою лабораторию таким образом, чтобы очищенную РНК можно было использовать непосредственно из остаточных образцов, используя пороговые значения цикла в качестве основных критериев отбора образцов; как кДНК, так и повторные множественные реакции ПЦР проводили с использованием пулов праймеров с полуночным разделением. Использование устройства Oxford Nanopore MinION Mk1C обеспечило бортовой базовый вызов Гуппи, уменьшив как время, так и количество шагов.

Таким образом, этот протокол подходит для внедрения в небольших лабораториях при больницах рентабельным способом, что позволяет упростить и децентрализовать процесс секвенирования. « После диагностической qRT-PCR подготовка мультиплексной библиотеки, контроль качества, секвенирование нанопор и биоинформационный конвейер могут быть полностью выполнены в течение одного рабочего дня ».

* Важное примечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.