Поскольку пандемия коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19) продолжает распространяться по всему миру, его возбудитель, коронавирус 2 (SARS-CoV-2), вызывающий его заболевание, находится под контролем на предмет появления новых вариантов. и изменения в вирусной биологии.

В интересах рентабельности и быстроты секвенирование вирусного генома на основе ампликонов было использовано для обеспечения чувствительных средств геномного надзора. Новый препринт, выпущенный на сервере bioRxiv *, показывает, как это можно настроить, чтобы сделать его надежным источником геномных данных за счет снижения известного потенциала заражения.

Важность секвенирования генома

Секвенирование генома было начато в начале пандемии, чтобы быстро идентифицировать вирус и разработать точные диагностические тесты во многих местах. С тех пор геномный надзор стал важным для отслеживания вирусного разнообразия, адаптации и передачи, что, в свою очередь, формирует политику сдерживания вирусов.

Скопления и сверхраспространение явлений особенно восприимчивы к идентификации этим методом. Однако это использование было вытеснено применением геномного секвенирования для мониторинга новых вызывающих озабоченность вариантов (ЛОС) и их распространения, особенно когда показано, что они демонстрируют изменения в их биологическом поведении.

Секвенирование на основе ампликона

Методы секвенирования генома на основе мультиплексных ампликонов показали необычную полезность в геномном надзоре за этим вирусом по сравнению с методами беспристрастного секвенирования РНК с низкой амплификацией. Плоды очевидны в виде загрузки сотен тысяч полных вирусных геномов за эти полтора года, большинство из которых – с помощью этого подхода.

Наиболее широко используемый метод амплификации специфического генома основан на использовании мозаичного набора праймеров с открытым доступом, разработанного сетью ARTIC. Затем амплифицированный геном секвенируется на платформах Illumina или нанопор, что приводит к созданию библиотеки.

Риск загрязнения

Основная проблема с высоким усилением – это неотъемлемый риск заражения. Полимеразная цепная реакция производит триллионы ампликонов SARS-CoV-2 примерно за 35 циклов, включая одну реакцию. Некоторые из них, само собой разумеется, могут быть в виде аэрозоля и загрязнять другие образцы.

Влияние этого на эксперименты, в которых чувствительность обнаружения вирусов измеряется десятками молекул, потенциально разрушительно. И это только усугубляется тем фактом, что почти сотня партий образцов может обрабатываться параллельно, что увеличивает риск обмена образцами или прямого перекрестного загрязнения.

Тот факт, что SARS-CoV-2, как уже считается, имеет сравнительно низкие уровни вирусного разнообразия и быстрое широкое распространение, затрудняет отличить ожидаемый идентичный генетический образец от того, который вызван заражением. Влияние этого на филогенетические исследования очевидно, как и клиническая важность неправильной идентификации варианта у больного пациента.

Риски многократно увеличиваются из-за того факта, что тысячи исследователей и исследовательских центров занимаются геномным надзором с учетом политики, установленной государственными чиновниками здравоохранения. С появлением ЛОС это число будет только расти, что подчеркивает необходимость строгого мониторинга, чтобы гарантировать достоверность геномных данных.

Вставки синтетической ДНК помогают надежно идентифицировать образцы

В текущем исследовании используются синтетические ДНК-шипы (SDSI) в качестве основы для нового метода идентификации образцов, который может быть адаптирован к существующим методам секвенирования. Такие всплески обычно используются в других методах секвенирования РНК для обнаружения загрязнения или замены образцов.

Исследователи назвали свой подход SDSI + ARTIC. Они сообщают, что его применение для секвенирования ампликонов позволит повысить надежность результатов при небольших дополнительных затратах времени или затрат и может быть использовано для исследования эпидемиологии и клинических характеристик вируса.

Критерии для SDSI

Используемые здесь SDSI имеют базовую последовательность с уникальной идентифицируемостью, с постоянными прайминговыми областями с обеих сторон. При такой конструкции можно включить еще один набор праймеров в мультиплексный ПЦР-анализ и, таким образом, амплифицировать как SDSI, так и первичную мишень реакции.

Критерии, существенные для этих дополнительных праймеров, включают их совместимость со многими различными реакциями ПЦР, их высокую специфичность для амплификации SDSI и амплификацию ампликонов SDSI со скоростями, аналогичными друг другу и первичной мишени.

Опять же, уникальные базовые последовательности SDSI должны отличаться как друг от друга, так и от геномных последовательностей, наиболее часто ожидаемых в лабораториях. При таком подходе несколько амплифицированных образцов можно обрабатывать параллельно, потому что их идентифицируемые SDSI надежно связываются с ними.

Таким образом, каждый образец имеет свой собственный внутренний контроль, помогающий обнаруживать замену образцов. Ассоциация "образец-SDSI" также проливает свет на вирусное заражение.

Используемые SDSI происходили из относительно редких и разнообразных архей чтобы избежать ложного обнаружения вариантов, основанных на гомологичных последовательностях. Они обнаружили, что 43 из 48 последовательностей показали более 75% гомологии в домене Archaea а остальные – с редкими бактериями, которые обычно не обнаруживаются в лабораториях.

Таким образом, они могут использоваться в самых разных приложениях. Исследователи также заметили, что каждый уникальный SDSI, вероятно, не может быть ошибочно принят за клиническое содержание и не гомологичен SARS-CoV-2 или Homo sapiens .

Использование дополнительных SDSI не имело вредного воздействия на вирусную амплификацию, и праймеры SDSI не казались достаточно похожими, чтобы ошибочно идентифицировать геномы. Конечные пары праймеров SDSI имели длину 24 п.н. и 46% содержания GC, тогда как генома SARS-CoV-2 составляло около 38%.

При одинаковом размере и области прайминга, а также схожем содержании GC ожидалось, что скорость амплификации будет одинаковой во всем спектре SDSI.

Каковы были результаты?

Исследование продемонстрировало отсутствие неспецифической амплификации, как и ожидалось, даже с комплементарной ДНК в образце мазка из носоглотки, что подтверждает гипотезу о том, что SDSI не гомологичны этому клиническому геномному материалу. Количество SDSI, добавляемого в каждую реакцию ПЦР, оптимизировано для предоставления преимуществ амплификации и секвенирования самим ампликонам SARS-CoV-2.

При 1 мкл SDSI 1fM более 96% считываний сопоставляются с SARS-CoV-2 при пороговых значениях цикла от 20 до 35 при сохранении того же геномного покрытия. Когда они протестировали SDSI на наборе из 48 клинических образцов вируса, они обнаружили, что 47 были обнаружены только в ожидаемом образце.

Единственное исключение, образец 47, показал 4% считываний в другой соседний SDSI, что указывает на возможное заражение первого вторым. Однако было также отмечено, что существуют две вариации с одним нуклеотидом (SNV), отличающие его от образца 48, что исключает контаминацию как единственный источник считывания вирусов.

Этот случай показывает потенциальную распространенность необнаруженного загрязнения и подчеркивает важность метода его идентификации ».

Оптимизация протокола

Исследователи также протестировали и отобрали модификации реакции ARTIC PCR для улучшения восстановления полных геномов с наименьшим числом считываний. К ним относятся удвоение концентраций праймеров для малоэффективных ампликонов и увеличение количества циклов до 40, что дает наивысшую амплификацию в диапазоне вирусных титров с наименьшим потенциалом ошибочных SNV.

Уменьшение общего количества реагентов для конструирования библиотеки помогло предотвратить излишне высокую амплификацию сверх количества, необходимого для секвенирования.

Сравнение с золотым стандартом

Мы наблюдали почти идеальное соответствие последовательностей при сравнении SDSI + ARTIC с несмещенным секвенированием, которое служило золотым стандартом для создания безошибочных вирусных геномов и для захвата расходящихся штаммов SARS-CoV-2 ».

При использовании для обнаружения предполагаемого кластера случаев, вызванных внутрибольничной передачей, в реальной жизни, исследователи смогли уверенно идентифицировать кластер инфекции в течение 52 часов, при этом 17/22 генома были полными более чем на 80%. Неполные геномы были взяты из образцов с порогом цикла ниже 30.

Из них 11 образцов были из кластера, а десять показали почти идентичность, что указывает на внутрибольничную передачу. Остальные образцы показали значительные отклонения, указывающие на независимо приобретенную инфекцию.

Каковы последствия?

Наша конструкция in silico генерировала надежные синтетические мишени, снижая при этом гомологию последовательностей между спайками, а также гомологию с человеческими, SARS-CoV-2 и обычными лабораторными реагентами. SDSI могут быть легко приняты лабораториями и платформами любого размера с незначительными изменениями существующих методологий, небольшими дополнительными затратами на образец (0,006 доллара в наших руках) и без прерывания или увеличения времени на стандартные методики рабочего процесса »

. ]

Использование SDSI решает ключевую проблему контаминации при секвенировании на основе ампликонов, позволяя использовать его преимущества.

SDSI позволяют обнаруживать загрязнения в партиях, а также в лаборатории в целом. Можно синтезировать больше мишеней для больших форматов и для других плиточных платформ ампликонов. Он также достаточно универсален, чтобы противодействовать новым технологиям секвенирования ампликонов.

Исследователи приходят к выводу:

SDSI могут служить широким инструментом для отслеживания потенциального загрязнения во множестве областей, в которых используется геномное секвенирование на основе ампликонов, таких как безопасность пищевых продуктов, идентификация видов и отбор проб окружающей среды »

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.