Новый коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), возбудитель пандемии коронавирусной болезни (COVID-19), сделал необходимым быстрое, чувствительное, специфическое и портативное тестирование, которое возможность немедленного развертывания в месте оказания медицинской помощи для мгновенного обнаружения вируса.

<img alt=" Исследование: Обнаружение вирусов на основе CRISPR-Cas: последние достижения и перспективы. Кредит изображения: nobeastsofierce / Shutterstock "height =" 800 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2021/8/shutterstock_1116935723.jpg "title =" Исследование: обнаружение вирусов на основе CRISPR-Cas : Последние достижения и перспективы. Изображение предоставлено: nobeastsofierce / Shutterstock "width =" 1200 "/> Исследование: Обнаружение вирусов на основе CRISPR-Cas: последние достижения и перспективы. Изображение предоставлено: nobeastsofierce / Shutterstock

Кластерные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы (CRISPR) и основанные на CRISPR-ассоциированные белки (Cas) системы молекулярной диагностики вирусных белков были широко исследованы. Белок CRISPR-Cas составляет основанную на нуклеиновых кислотах адаптивную иммунную систему бактерий и архей, которая использует нуклеазы, управляемые РНК, для расщепления вторгающихся нуклеиновых кислот. Ученые использовали этот феномен, и этот механизм используется для обнаружения вирусного генетического материала.

Системы CRISPR-Cas, особенно CRISPR-Cas12a и CRISPR-Cas13a, известны своей чувствительностью, специфичностью, высоким разрешением оснований и возможностью программирования для распознавания специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Они использовались для идентификации таких вирусов, как Зика, Эбола, Грипп A и вирус папилломы человека.

Исследователи из Китая недавно рассмотрели последние достижения, приложения и перспективы обнаружения вирусов с использованием систем CRISPR-Cas, особенно CRISPR-Cas12a / Cas13a, в обзоре Biosensors and Bioelectronics .

Что такое CRISPR и как он помогает обнаруживать вирусные инфекции?

Cas представляет собой основанный на нуклеиновых кислотах механизм распознавания генов, запрограммированный на распознавание и расщепление определенных частей вирусного генетического материала или РНК и параллельную выдачу различных сигналов машине для считывания и анализа результатов.

Самыми популярными белковыми системами CRISPR Cas являются системы CRISPR типа II с Cas9, системы типа V с Cas12a (также известные как cpf1) и системы типа VI с Cas13a. Основная направляющая РНК (sgRNA) распознает короткую специфическую последовательность, называемую PAM (Proto-spacer Adjacent Motif), которая помогает Cas9 распознавать и расщеплять специфическую двухцепочечную ДНК (дцДНК), нарушая структуру ДНК с помощью присутствующих специфических белков. в Cas9.

Основной механизм расщепления вирусного генома на основе CRISPR Cas остается одинаковым для систем CRISPR Cas12a и CRISPR Cas13a. Однако оба типа оборудования могут обнаруживать два разных типа вирусного генетического материала

• CRISPR Cas12a обнаруживает одноцепочечную (оцДНК) или дцДНК, которая, в случае РНК-вирусов, требует обратной транскрипции с РНК

• Система CRISPR Cas13a может легко распознавать одноцепочечную РНК (оцРНК), для которой не требуется обратная транскрипция.
  • Еще одно преимущество системы CRISPR Cas13a состоит в том, что ей требуется относительно простая специфическая последовательность, известная как сайт фланкирования протоспейсера (PFS), по сравнению с CRISPR Cas12a,

Каково значение и важность CRISPR для обнаружения вирусов?

Система CRISPR Cas13a была использована для создания метода специфической высокочувствительной разблокировки ферментативного репортера (SHERLOCK) для обнаружения вирусного генетического материала в образцах пациентов. Другая диагностическая система, известная как CRISPR Trans Reporter, нацеленная на ДНК-эндонуклеазы (DETECTR), была создана с использованием системы CRISPR-Cas12a. Системы SHERLOCK и DETECTR использовались по-разному с различными системами анализа сигналов для обнаружения различных форм вирусов (вирусов растений, животных и человека).

Некоторые яркие примеры включают,

• Обнаружение вируса Зика, вируса денге, вариантов вируса папилломы человека (ВПЧ) и даже вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса Эбола, вируса Ласса, вируса гриппа А, вируса африканской чумы свиней, парвовируса собак, вируса синдрома белых пятен , Вирус курчавых побегов табака и совсем недавно SARS-CoV-2 – все они использовали комплекс гасителя флуорофоров вместе с белками CRISPR Cas12a и 13a, которые испускали флуоресцентные сигналы, которые считывались считывающими устройствами микропланшетов, сенсорами смартфонов, микрожидкостными чипы, инструменты для 3D-печати или светодиодные фонари

• Обнаружение вируса африканской чумы свиней, вируса язвы и бороздки на стебле яблони, вируса красной пятнистости рапса с использованием колориметрических сигналов с использованием наночастиц золота, которые могут быть обнаружены невооруженным глазом, а также спектрофотометров (путем измерения спектров поглощения)

• Варианты вируса папилломы человека и парвовируса также были обнаружены с использованием путей передачи сигналов и генерации электрохимических сигналов при обнаружении специфического белка

• Вирусы даже были идентифицированы с помощью анализов бокового потока, которые включают взаимодействие антиген-антитело или взаимодействие между последовательностью ДНК-мишени и ДНК зонда, с использованием конъюгированных наночастиц золота, углерода или окрашенного латекса в подушечке конъюгата

• Благодаря высокой чувствительности и специфичности методов они были модифицированы для специфического обнаружения мутантов вирусов путем изменения очень специфических последовательностей в материале ДНК / РНК зонда; это становится решающим при тестировании мутирующих вариантов новых вирусов, таких как коронавирус SARS

<img alt=" Фиг. 3. Обнаружение вирусов с различными показаниями сигналов. (A) Распознавание вирусов на основе CRISPR-Cas12a / Cas13a с помощью флуоресцентных сигналов. (B) Распознавание вирусов с помощью колориметрических сигналов. (C) Обнаружение вирусов с помощью электрохимических сигналов. "Height =" 800 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2021/8/1-s2.0-S0956566321005789-gr3_lrg.jpg " title = "Рис. 3. Обнаружение вирусов с различными показаниями сигналов. (A) Распознавание вирусов на основе CRISPR-Cas12a / Cas13a с помощью флуоресцентных сигналов. (B) Распознавание вирусов с помощью колориметрических сигналов. (C) Обнаружение вирусов с помощью электрохимических сигналов. "Width =" 1200 "/> Рис. 3. Обнаружение вирусов с помощью различных считываний сигналов. (A) Обнаружение вирусов на основе CRISPR-Cas12a / Cas13a с помощью флуоресцентных сигналов. (B) Определение вирусов с помощью колориметрических сигналов. (C) Определение вирусов с помощью электрохимических сигналов.

Каковы проблемы и перспективы CRISPR в будущем обнаружения вирусов?

Теперь стало возможным обнаруживать вирусный генетический материал благодаря высокому разрешению, чувствительности и специфичности систем CRISPR Cas 12a и 13a. С точки зрения разрешения их можно использовать для обнаружения генетического материала на фемтомолярном (fM) (без амплификации) или аттомолярном (aM) (с амплификацией) уровнях. С помощью этого революционного диагностического инструмента можно обнаружить даже мутации на уровне одного нуклеотида.

Существовали проблемы в виде отсутствия методов стандартизации, подготовки и предварительной обработки образцов без контаминации, получения точного количественного анализа вирусной нагрузки из образцов и даже получения желаемой длины целевых последовательностей для использования в диагностике. испытания.

CRISPR Cas-системы обладают огромным потенциалом не только для обнаружения вирусного генома, но и для модификации и редактирования генов. Он может революционизировать биосенсорную и молекулярную диагностику для достижения наилучших результатов в будущем.