Предварительное исследование, проведенное учеными из Института медицинских исследований Гарвана и Университета Нового Южного Уэльса и опубликованное на сервере препринтов bioRxiv * в июне 2020 года, сообщает об использовании химерного дизайна для производства эталонных стандартов для диагностические тесты. Это может позволить очень гибкий подход к развитию различных генетических признаков в одном и том же тесте, даже для организмов, которые не имеют прямого отношения.

Использование синтеза ДНК в диагностике COVID-19

С продолжающейся пандемией COVID-19, диагностические и терапевтические меры все еще интенсивно развиваются. Относительно диагностических тестов, основанных на обнаружении и количественном определении вирусной РНК или ДНК, необходимы эталонные стандарты. Синтез ДНК – это новая технология, используемая для создания синтетических молекул, которые выступают в качестве мишени для методов генетического обнаружения.

Эти молекулы могут быть использованы для быстрого получения большого количества эталонных стандартов и могут даже включать последовательности из других организмов для удовлетворения потребностей конкретного анализа. В настоящем исследовании этот метод используется для создания искусственных эталонных последовательностей, содержащих праймеры для всех анализов тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2), которые в настоящее время публикуются Всемирной организацией здравоохранения.

Эти синтетические ссылки можно использовать в качестве положительных контролей, при этом их реакция показывает чувствительность оцениваемого молекулярного теста. С другой стороны, отрицательные контроли, в которых отсутствуют целевые последовательности, также должны использоваться для определения специфичности теста.

Проблемы с природными конструкциями

Любая ссылка должна быть сначала проверена и показана как подходящая для целей испытания. При использовании последовательностей РНК контрольные конструкции со временем разрушаются, и также возможно загрязнение, что может привести к путанице в результатах испытаний. Возможность сбоя может быть со стороны теста, контроля или метода. Такие сбои вызывают диагностические задержки, ошибочный диагноз и непринятие достоверных результатов испытаний.

Синтетические химерные конструкции

По этой причине стандарты РНК и ДНК в настоящее время синтезируются in vitro, чтобы сделать процесс проектирования более гибким и, таким образом, предлагать индивидуальные элементы управления, которые соответствуют диагностическому тесту и целям. В настоящем документе сообщается о новой стратегии разработки эталонных стандартов, в которых используются химерные синтетические стандарты, согласованные друг с другом для соответствия стандартам методологии тестирования, называемой A / B-тестированием.

Целевые последовательности молекулярного теста сначала получают и разделяют на две группы A и B. Затем они соединяют друг с другом, чтобы получить одну химерную последовательность. Преимущество равного разделения целевых последовательностей между двумя группами состоит в том, что каждая мишень имеет свой положительный контроль в одной группе и отрицательный контроль в другой группе, причем положительные и отрицательные значения могут быть в любой группе.

Этот тип равного разделения позволяет элементам управления проверять друг друга, делая результаты теста более надежными и позволяя отличить элемент управления от неудачного или успешного теста. Таким образом, целевые области одного организма можно тестировать вместе, даже если они совершенно разные. То же самое относится к целевым областям от разных организмов.

Современный подход: химерные пары для валидации

Используя этот подход, исследователи использовали пару химерных стандартов A / B для проведения диагностического тестирования ОТ-ПЦР на SARS-CoV-2 в соответствии с тестами в реальном времени, рекомендованными Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). , Оба стандарта имели участки вирусного генома, которые распознаются по опубликованным парам праймеров и совместимы с уже лицензированными и одобренными диагностическими тестами.

В текущем исследовании рассмотрены характеристики этих контролей по сравнению с другими эталонными последовательностями и клиническими образцами, показано, как эти синтетические конструкции могут быть использованы для проверки как ОТ-ПЦР, а также показано, как их можно использовать в других тестах, как хорошо.

Первым шагом было получение последовательностей вирусного генома для исходного изолята и всех опубликованных ВОЗ последовательностей праймеров для шести стран, 3 в Азии, 2 в Европе и США. Каждый доступный в настоящее время тест использует две или три пары праймеров, направленных против различных частей геномной последовательности. Они были выровнены по всему геному, чтобы идентифицировать местоположения амплифицированных последовательностей. Эти ампликоны были получены с 30 нуклеотидами, принадлежащими каждому концу.

Этот дизайн позволяет использовать химерные стандарты в каждой стране отдельно в качестве контрольных тестов, а также общий стандарт для прямого сравнения результатов испытаний и эффективности в различных наборах праймеров, зондов и стран.

Эти восстановленные последовательности были затем разделены на две контрольные группы, а именно, химерные стандарты A / B. Страновые целевые регионы были назначены на две разные группы, после чего регионы были собраны в тандеме. Химерный стандарт B также содержал последовательность из гена человеческой РНКазы P (RP), использованную в качестве положительного человеческого контроля.

Так же, стандарты содержали уникальную последовательность управления, чтобы помочь обнаружению каждого из них, если это необходимо. Каждый из них имел начальную промоторную область, поэтому он мог транскрибироваться in vitro с концевым поли-А-хвостом и сайтом рестрикции для обеспечения возможности линеаризации вектора.

Затем были синтезированы две разные стандартные последовательности A / B. Продукт клонировали в плазмиды, которые затем линеаризовали и транскрибировали in vitro. Конечным продуктом были стандарты синтетической РНК после очистки и проверки.

Затем они использовали другие контрольные контроли для проверки химерных стандартов и протестировали их на геномы от 12 пациентов с COVID-19, которые уже были независимо секвенированы. Как и ожидалось, ОТ-ПЦР диагностировала как химерные стандарты, так и образцы пациентов, причем целевые гены N1, N2 и N3 были амплифицированы в РНК пациента и кДНК пациента.

Исследователи обнаружили, что оба стандарта могут быть обнаружены до 10 ^-4 или предела обнаружения для количества копий 0,39 и 0,42 копий / мкл для стандартов A и B соответственно.

Будущие приложения

Приложения для этой технологии включают не только новую диагностическую технологию, но также тестирование на множественные генетические особенности, такие как мутации и вирусные последовательности, раковые мутации и генные сигнатуры. Во-вторых, когда текущая пандемия начинает уменьшаться, такой контроль потребуется для точной и быстрой диагностики инфекции.

Исследование подводит итог: «Химерный A / B-подход обеспечивает новую модель для разработки экономически эффективных эталонных стандартов, которые позволяют контролировать несколько экспериментальных переменных на основе простых, но всеобъемлющих схем».

* Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как убедительные, направлять клиническую практику / поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.