Многоугловое рассеяние света (MALS) представляет собой мощный инструмент для непосредственного измерения молярной массы белков, нуклеиновых кислот и комплексов в растворе без флуоресцентной или радиомаркировки.

В этом интервью доктор София Кенрик рассказывает News-Medical Life Sciences о двух дополнительных методах рассеяния света – эксклюзионной хроматографии в сочетании с многоугольным рассеянием (MALS) и составные градиенты MALS, которые предоставляют инструменты для определения характеристик нуклеиновых кислот и взаимодействия между нуклеиновыми кислотами и белками.

Можете ли вы объяснить важность изучения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота?

Биотерапевтические средства, разрабатываемые сегодня для лечения многочисленных расстройств, основаны на широком спектре биополимеров. Как правило, биотерапевтические средства были сконструированными антителами, но теперь для производства терапевтических агентов используются все виды биополимеров. Биотерапевтические препараты на основе ДНК и РНК становятся все более распространенными в качестве противоопухолевой иммунотерапии и противораковых вакцин.

Эффективность такого лечения зависит от доставки РНК в иммунные клетки и превращения их в агенты, нацеленные на опухоль. Аспект доставки имеет решающее значение для его эффективности. Поэтому важно, чтобы мы понимали свойства используемых биополимеров и то, как они взаимодействуют с другими биологическими соединениями, чтобы сделать их максимально эффективными. Биофизическая характеристика, таким образом, имеет важное значение. Например, эффективность доставки может зависеть от того, сколько полимера конъюгировано с вашей РНК, или процесс очистки может заставить вашу одноцепочечную РНК образовывать дуплексы, которые вам не нужны.

Характеризация взаимодействий между нуклеиновыми кислотами и белками-хозяевами или другими молекулами также имеет решающее значение для понимания основной биологии как здоровых, так и болезненных состояний. Получение подробной информации о том, как эти молекулы связываются, помогает нам понять взаимосвязь структуры / функции и дает информацию о разработке чувствительных или высокоаффинных биосенсоров.

Изображение предоставлено: Shutterstock / GiroScience

Как можно использовать рассеяние света для характеристики таких взаимодействий?

Исследования рассеяния света могут предоставить ключевую информацию о размере, молярной массе и конформации этих комплексов. Как молярная масса молекул, так и сила взаимодействия с их связывающими лигандами могут быть измерены непосредственно без необходимости маркировки или стандартов молярной массы. Это снижает риск возникновения артефактов.

Существует несколько способов применения методов рассеяния света для характеристики ДНК и РНК. MALS, динамическое рассеяние света и электрофоретическое рассеяние света могут быть использованы для характеристики физических свойств, таких как размер, молекулярный вес и заряд.

Какие из методов рассеяния света использовались в тематических исследованиях?

В обоих тематических исследованиях используется многоугловое рассеяние света или MALS. Когда лазер направлен на раствор, большая часть света проходит сквозь него, но часть света рассеивается во всех направлениях молекулами, находящимися в растворе. Интенсивность рассеянного света пропорциональна молярной массе, концентрации и приращению показателя преломления, или dn / dc. Таким образом, измеряя интенсивность рассеяния света, вы можете напрямую рассчитать молярную массу этих молекул в растворе.

Рассеяние света измеряется под несколькими углами одновременно. Это важно, так как изменение угла рассеяния пропорционально размеру этой молекулы и может быть использовано для определения радиуса молекулы или частицы, и это очень важно для понимания больших молекул ДНК и мРНК.

В первом тематическом исследовании показано использование MALS с эксклюзионной хроматографией (SEC-MALS) для характеристики комплекса ДНК и белка путем анализа каждого из видов, присутствующих в растворе. Во втором тематическом исследовании CG-MALS используется для непосредственного измерения аффинности связывания и стехиометрии комплекса в растворе.

Изображение предоставлено: Shutterstock / nobeastofierce

Как SEC-MALS используется при изучении биологических комплексов?

Иногда, даже когда разделение по ВЭЖХ или ВЭЖХ является идеальным, молярная масса образца, оцененная только на основе времени элюирования, не соответствует молярной массе стандарта. Это несоответствие может возникнуть, когда образец и стандарт имеют разную плотность и другую конформацию.

В SEC-MALS поток, вытекающий из колонки ВЭЖХ или ВЭЖХ, течет в УФ-детектор, наш многоугловой детектор рассеяния света и детектор показателя преломления (RI). Ультрафиолетовый или RI-детектор обеспечивает измерение концентрации, которое используется вместе с данными интенсивности MALS для расчета истинной молярной массы. Измерение MALS также подтверждает, что раствор полностью отделен, показывая, являются ли пики однородными с точки зрения молярной массы или неоднородными.

Этот анализ не так прост для комплекса, состоящего из двух разных типов молекул. Каждый компонент имеет различный коэффициент ослабления и разные значения dn / dc. В таких случаях нам необходимо применить «анализ конъюгата белка», в котором все три детектора определяют количество каждого компонента в нашем комплексе напрямую.

Измерение концентрации с использованием УФ-детектора и детектора рентгеновского излучения дает нам массовую долю и молярную массу каждого компонента. Существует множество применений для этого метода, таких как гликозилированные или пегилированные белки или полисахарид, функционализированный пептидами или нуклеиновыми кислотами. Можно охарактеризовать даже нековалентные комплексы, такие как количество липидов, связанных с мембранным белком, или, в нашем случае, комплексы белок-нуклеиновая кислота.

ImageCredit: Шаттерсток / Billionphotos

Как это было применено в вашем тематическом исследовании SEC-MALS?

Подход SEC-MALS и анализ конъюгата белка был применен к комплексу прототипа пенистого вируса (PFV) интегразы и вирусной ДНК, который называется интасомой.

Коэффициент экстинкции, полученный для PFV-интегразы с использованием УФ и RI одновременно, был почти вдвое меньше, чем мы ожидали, основываясь только на последовательности, но измерение молярной массы как с помощью концентрации RI, так и концентрации УФ подтверждает, что это правильно. Уже сейчас это полезная информация о комплексе, которая поможет в определении молярной массы.

Переходя к интасоме, сигналы рассеяния света, УФ и RI использовались для расчета молярной массы и массовых долей каждой части в каждой точке хроматограммы.

Это показало, что доля белка составляет около 90%, то есть 90% массы составляет белок, а около 10% – ДНК. На основании этой информации мы получили dn / dc для всего комплекса и коэффициент экстинкции для всего этого комплекса. Мы использовали эту концентрацию и этот dn / dc, чтобы затем вычислить молярную массу. Общая молярная масса составляла 194 килодальтон, поэтому мы знаем, что белковая часть составляет 174 килодальтон, а ДНК – около 20 килодальтон. Это эквивалентно тетрамеру интегразы и двум цепям ДНК, что соответствует кристаллической структуре.

Было замечено, что молярная масса не была постоянной поперек пика, что указывает на то, что диссоциация тетрамера белка могла происходить во время разделения или некоторые виды могут не быть насыщенными. Следующее тематическое исследование показывает, как мы можем измерить эти виды сродства и стехиометрии в растворе.

Так чем же отличается CG-MALS от SEC-MALS?

CG-MALS – это метод, который позволяет нам измерять сродство и стехиометрию комплексов, образующихся в растворе.

В отличие от предыдущего примера, MALS применяется к нефракционированным образцам. Серия образцов различного состава вводится в детекторы рассеяния света и концентрации, поэтому мы можем использовать MALS для определения молярной массы для каждого состава. Затем изменение молярной массы может быть связано с образованием комплексов в растворе.

Таким образом, мы можем оценить самоассоциацию и равновесие между мономером и димером и димером и тримером. Измеряя молярную массу как функцию концентрации, мы можем определить сродство самоассоциации и стехиометрию.

Если комплексы не образуются, молярная масса будет оставаться постоянной в зависимости от концентрации. По мере образования комплексов, таких как димеры и тримеры, мы видим увеличение молярной массы в зависимости от концентрации. Используя соответствующую модель, мы можем подогнать это увеличение, чтобы сообщить нам сродство и стехиометрию ассоциации.

Тот же самый метод может быть применен к взаимодействию между двумя различными разновидностями. В состав просто входят различные концентрации обоих видов. Мы получаем измерения, когда каждый из видов в избытке, поэтому мы можем отобрать всю стехиометрию этого взаимодействия.

По мере образования комплексов молярная масса этого раствора увеличивается, давая характеристическую кривую. Чем больше комплексов связывает, тем сильнее взаимодействие. Это делает пик выше и острее.

Кроме того, положение пика говорит нам о стехиометрии раствора. Если у вида B есть один сайт связывания для вида A, мы увидим вершину пика в молярном соотношении 1: 1. Если каждый B может связать две молекулы A, мы увидим максимум при молярном соотношении 2: 1 и т. Д.

Кроме того, поскольку метод CG-MAL напрямую измеряет молярную массу, мы можем определить разницу, скажем, между взаимодействием 1: 1 и 2: 2. Они оба достигнут максимума в одной и той же позиции, но мы все еще можем различить, так как комплекс 2: 2 будет иметь удвоенную молярную массу.

Какой комплекс был изучен с использованием CG-MALS в вашем втором примере?

CG-MALS использовали для исследования рекомбиназы Cre в комплексе с сайтом распознавания ДНК loxP.

Во-первых, мы использовали градиент концентрации Cre, чтобы измерить молярную массу только этого белка и определить, ассоциируется ли он сам. Аналогичный тест был проведен для ДНК сам по себе. Измерения MALS были проведены для каждой молекулы в пяти различных концентрациях.

Молярная масса каждой молекулы не увеличивалась во всем диапазоне концентраций, показывая, что они вообще не являются самоассоцирующимися. Cre дает постоянную молярную массу 39 килодальтон, что соответствует мономеру, а молярная масса ДНК измеряется постоянной 23 килодальтон, которая также является мономером.

Затем была изучена связь между ферментом и ДНК. Смеси белка и ДНК в 13 различных концентрациях анализировали в проточной ячейке MALS. Увеличение интенсивности рассеяния света было пропорционально увеличению молярной массы с течением времени по мере образования комплексов Cre / loxP.

Было найдено, что молярная масса в равновесии составляет около 110 килодальтон. Это сразу сказало нам, что стехиометрия больше 1: 1, так как 39 плюс 23 – только 62.

Пик был в правильном положении для отношения связывания 2: 1, но молярная масса была все еще больше, чем должна быть для такого комплекса, предполагая, что формируются некоторые структуры более высокого порядка, а не стандартное 1: 1. или комплекс 2: 1. Это подтверждается искривлением при высоких соотношениях ДНК и белка, который не захватывается простой моделью 2: 1.

Измерение молярных масс показало, что на самом деле было три разных комплекса. Первый – это белок Cre, связанный с ДНК, и это первое связывание происходит с константой диссоциации равновесия 170 наномоляр.

Затем второй Cre соединяется с этим комплексом совместным образом. Как только один Cre-белок связан с ДНК, сродство ко второму увеличивается. Наконец, этот гетеротетрамер Cre-loxP димеризуется со сродством 400 наномоляр.

Один эксперимент CG-MALS, в котором были исследованы концентрации в несколько сотен наномоляр для каждого вида, позволил нам полностью описать этот трехступенчатый механизм связывания.

Не было необходимости работать в нескольких режимах концентрации или предполагать, что один или несколько из этих сайтов связывания полностью насыщены или что одна часть этой реакции незначительна. Вы можете получить полную характеристику и измерить все это одним экспериментом.

Мало того, что вы получаете сродство и стехиометрию, но CG-MALS также дает вам состав раствора для каждой смеси.

Изображение предоставлено: Shutterstock / UGREEN3S

Можете ли вы дать нам краткое изложение двух тематических исследований?

Да, надеюсь, я также показал, что рассеяние света при фракционировании или в периодическом режиме не только для белков. Эти же анализы имеют решающее значение для ДНК и РНК, а также для характеристики нуклеиновых кислот в комплексе с другими молекулами.

В двух тематических исследованиях были выделены два различных вида характеристик, которые можно получить для аналогичных систем белок / ДНК с использованием MALS.

SEC-MALS с анализом конъюгата белка дали нам абсолютную молярную массу и фракцию белка и ДНК для вирусной интегразы, связанной с ее ДНК-лигандом. Это было сделано без стандартов молярной массы и без предположения о стехиометрии.

CG-MALS в пакетном режиме без хроматографии позволяет количественно определить сродство и стехиометрию этого комплекса при многоступенчатом взаимодействии белок / ДНК. Анализ взаимодействия не требует маркировки или иммобилизации.

Где наши читатели могут узнать больше?

Чтобы узнать больше, посетите наш веб-сайт – www.wyatt.com/SEC-MALS и www.wyatt.com/CG-MALS.

О Софии Кенрик

Д-р. София Кенрик – старший научный сотрудник Wyatt Technology, где она поддерживает несколько приложений для Wyatt Instrumentation, особенно в области молекулярного распознавания и биомолекулярных взаимодействий.

София является директором аналитических служб и деканом университета рассеяния света в кампусе Санта-Барбара.