Использование ЯМР для изучения структуры, динамики и механизмов белка

Использование ЯМР для изучения структуры, динамики и механизмов белка
        

Интервью с Фабио Алмейдой, в котором он рассказывает о работе, которую он выполняет в Университете Рио-де-Жанейро в Национальном центре ЯМР, с участием структуры и динамики белков.

Не могли бы вы представить себя и исследования, которые вы проводите в Федеральном университете Рио-де-Жанейро?

Меня зовут Фабио Алмейда. Я работаю в Федеральном университете Рио-де-Жанейро в Национальном центре ЯМР, который является частью Центра структурной биологии и биоизображения.

Это многопользовательское средство открыто для ряда пользователей в университете, а также для пользователей из других университетов и исследовательских учреждений в Бразилии и за рубежом. Наши ЯМР-спектрометры размещены в отделе структурной биологии, но у нас также есть другие устройства, доступные для биоизображения мелких животных и микроскопии.

Мое исследование сосредоточено на трех темах. Все они связаны со структурой и динамикой белков, при этом основное внимание уделяется роли динамики и белковых механизмов.

ЯМР в исследованиях рака из AZoNetwork на Vimeo.

Я изучаю тиоредоксин, который является очень известным белком. Структура была решена более трех десятилетий назад, но все еще существуют динамические и структурные элементы, которые необходимо описать. Недавно мы описали один из этих динамических элементов; это водная полость, которая является важной и ключевой для биологического механизма белка.

Мы также изучали тиоредоксин у высших эукариот, у которых было усиление функции – способность выполнять посттрансляционные модификации, такие как переходные колебания и дилатации. Механизм, который обеспечивает переходные колебания, не очень хорошо известен, поэтому мы используем ЯМР для изучения этого механизма.

Другая часть нашей работы касается капсидных белков флавивируса. Мы описываем механизм связывания капсидных белков вируса денге с внутриклеточными липидными каплями, который связан с метаболизмом липидов. Это связывание имеет важное значение, поэтому мы использовали ЯМР для картирования взаимодействия этого капсидного белка вируса денге с этими липидными каплями. Поскольку связывание имеет важное значение, мы знаем, что это может пролить свет на то, как разрабатывать новые соединения, которые могут его предотвратить.

Совсем недавно мы изучали капсидные белки вируса Зика, для которых мы только что определили структуру. Мы проводим аналогичные исследования взаимодействия капсидных белков вируса Зика с внутриклеточными молекулами, чтобы опосредовать его биологический механизм.

Все эти взаимодействия включают динамику этих капсидных белков флавивируса, поэтому ЯМР уникален и очень важен для таких исследований.

Как ЯМР используется для изучения структуры белка?

ЯМР является одним из трех методов, используемых для изучения структуры белка, другими являются рентгеновская кристаллография и криомикроскопия. ЯМР является единственным методом, который позволяет проводить исследования в растворе, что очень важно. ЯМР также может быть использован для проведения исследований в твердом состоянии.

ЯМР является особым и уникальным, поскольку вы можете изучать не только структуру, но и динамику белка. Используя ЯМР, мы можем измерить динамические свойства каждого ядра в белке, что очень важно, потому что динамика тесно связана с биологическим механизмом белка.

Недавно произошла революция в структурной биологии, включающая криоэлектронную микроскопию. Этот метод позволяет разрешать структуры высокомолекулярных комплексов, что очень важно.

ЯМР играет очень важную роль в этой новой области структурной биологии, потому что это единственный метод, который позволяет изучать динамику. Например, множественные домены, наблюдаемые в некоторых белках, приобретают функцию в эволюции, поэтому они очень важны, и ЯМР может помочь нам понять движение этих доменов.

Тридцать процентов генома имеют то, что мы называем внутренне беспорядочными областями, которые являются сегментами белка, которые не имеют уникальной структуры. Важно отметить, что внутренне неупорядоченный регион на самом деле является точкой гибкости.

В этом смысле ЯМР снова является уникальным, поскольку он является единственным методом, который позволяет нам понять эти линкеры в многодоменных белках. Эти линкеры также присутствуют в меньших белках. Мы также можем назвать их «энтропийными линкерами», потому что они способствуют энтропии системы и являются ключом к биологическому механизму.

<img alt=" ЯМР Фабио "src =" данные: изображение / gif; base64, R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP /// yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7 "data-src =? – data-style = "width: 680px; height: 433px; "title =" NMR Fabio "class =" lazy-load-image "width =" 1513 "height =" 963 "/>

Почему это важно в контексте патогенов человека и белков, участвующих в возникновении заболевания?

Весь патогенез осуществляется белками и нуклеиновыми кислотами – возможно, их связь друг с другом и, иногда, распознавание углеводов и полисахаридов. ЯМР уникален, потому что мы можем использовать его для наблюдения и измерения свойств непосредственно на атомном уровне.

Для всех этих биологических макромолекул (белков, углеводов и нуклеиновых кислот) ЯМР является одним из основных методов исследования и постановки биологических вопросов.

С помощью ЯМР мы можем измерить не только структуру белка, но и динамику каждого сегмента в этих молекулах и динамику взаимодействия. Все биологические механизмы включают взаимодействия между этими молекулами в клетке: белок-белковые взаимодействия, взаимодействия РНК-ДНК, а также белок-углеводные взаимодействия в малых молекулах.

Эти взаимодействия представляют все патологические механизмы и вовлеченные биологические механизмы, и ЯМР очень хорош для их измерения, и роль играет динамика. В этом смысле ЯМР является очень мощным инструментом.

Как образцы готовятся для ЯМР анализа?

Для приготовления белков вам необходимо выбрать интересующий ген – ген, который вовлечен в патологический или биологический механизм, который вы стремитесь изучить. Вам нужно клонировать этот ген в бактериях или эукариотической системе. Бактерии используются чаще, но есть несколько вариантов клонирования генов в этих гетерологичных системах.

Затем вы экспрессируете этот белок, который позволяет пометить его изотопом. Вы можете достичь белка с азотом 15, углеродом 13, дейтерием и, возможно, другими ядрами, которые вовлечены в этот биологический механизм. Тем не менее, это три магнитно-активных ядра, которые важны для проведения измерений ЯМР.

После маркировки и очистки белка необходимо настроить рабочие условия для проведения исследований ЯМР. Вы должны установить температуру, pH и имитировать физиологические условия как можно ближе. Затем вы можете проверить, например, влияние осмолитов и влияние высокого давления. Вы можете поместить образец в различные условия и проверить, что же происходит со структурой и динамикой белка.

Таким образом, подготовка образца включает клонирование гена, экспрессию белка, маркировку белка изотопом, его очистку и затем проведение биологических анализов, чтобы увидеть, какие идеальные условия для работы с белком.

Как ЯМР-спектроскопия может быть использована для изучения биологии рака и может ли она служить руководством для разработки новых методов лечения?

Существует несколько раковых мишеней, главным образом белков, которые экспрессируются так называемыми онкогенами, генами, которые экспрессируют белки, участвующие в образовании опухолей. Обычно эти белки участвуют в контроле клеточного цикла. Белок может быть опухолевым супрессором, таким как р53, который участвует в 50% всех случаев рака. Мутации в этом белке ответственны за нарушение регуляции клеточного цикла, который является основной причиной рака.

Сказав это, ЯМР также сыграл ключевую роль в понимании биологической роли, а также структуры и динамики р53, поэтому было опубликовано несколько статей по этому белку.

ЯМР уникален в этом смысле, потому что вы также можете исследовать другие эффекты, такие как агрегация. В нашем университете есть группа, которая изучает агрегацию р53 и то, как она способствует развитию и трансформации клетки, что приводит к образованию рака.

ЯМР уникален тем, что вы можете исследовать эффекты в растворе, например, определить структуру, измерить динамику или подвергнуть протеины воздействию условий испытаний. У нас также есть группы в этом учреждении, которые изучают другие связанные с раком мишени, такие как Grb2, другой модулятор клеточного цикла. На самом деле есть еще много примеров, которые я мог бы перечислить здесь.

<img alt=" Изображение, показывающее белки на поверхности клетки, которые можно анализировать с помощью ЯМР-спектроскопии. "Src =" data: image / gif; base64, R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP /// yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBrAd = image-s-data / s-image picture = 2019% 2f7% 2fshutterstock_393979900.jpg "data-data-style =" width: 100%; "title =" Изображение, показывающее белки на поверхности клетки, которые можно проанализировать с помощью ЯМР-спектроскопии. "class =" lazy-load- image "width =" 1000 "height =" 571 "/> urfin | Shutterstock

На что вы обращаете внимание при выборе нового оборудования для вашей лаборатории?

Во-первых, вы должны очень тщательно подумать о том, какова научная цель, и быть очень точным о том, для чего будет использоваться спектрометр. Если спектрометр будет использоваться для общих целей, существует очень высокая вероятность того, что ошибки будут допущены. Вам не нужно быть слишком конкретным, но хорошо бы решить, будет ли машина использоваться, например, для анализа структуры и динамики или малых молекул.

Как только вы определитесь с научной целью и тем, для чего будет использоваться инструмент, вы также можете понять, когда выбираете магнитное поле, которое в значительной степени определяет, сколько будет стоить. Иногда гораздо лучше использовать три спектрометра с более низкими полями, которые будут стоить столько же, сколько и более высокопольный, так что это очень важный момент для рассмотрения.

Далее нужно выбрать электронику. Вы должны точно определить каждую деталь электроники, чтобы сделать спектрометр идеальным для того, для чего вы его используете. Вам нужно решить, сколько каналов вам нужно, исходя из того, сколько ядер вы собираетесь измерить. Здесь, например, все наши спектрометры имеют четыре канала, потому что мы измеряем протоны, азот 15, углерод 13 и дейтерий … хотя не всем нужны четыре канала. Вам также необходимо выбрать импульс и, следовательно, мощность, которую вы будете использовать для каждого канала. Например, вам могут понадобиться очень короткие импульсы, что означает, что вам нужна высокая мощность, например.

После того, как вы выбрали и установили электронику, вы должны проверить, работает ли она так, как вам нужно. Вам необходимо настроить его в соответствии со спецификациями компании, касающимися стабильности магнитного поля, стабильности импульсного поля и т. Д.

Техническое обслуживание также очень важно, особенно для нас, находясь в Бразилии и так далеко от Европы и Соединенных Штатов, где находятся самые большие центры. Вам необходимо проверить, есть ли в вашей стране сервисная бригада компании, которая могла бы, например, решить любые проблемы с электроникой, а также иногда помочь вам в эксперименте. Это партнерство с компанией очень важно.

Другим важным моментом является привлечение кого-то, кто является экспертом в области ЯМР, либо менеджером ЯМР, который имеет степень доктора философии. в ЯМР или кто-то, кто специализируется на использовании спектрометра ЯМР. Это так же важно, как и качество оборудования.

Что отличает ЯМР-спектрометр от Bruker от других представленных на рынке ЯМР-спектрометров?

В нашем центре ЯМР у нас есть шесть ЯМР-спектрометров Bruker с несколькими значениями напряженности магнитного поля. Bruker предлагает качественное оборудование, которое постоянно совершенствуется. Магниты очень однородны и стабильны, и в них используется только небольшое количество гелия, что дорого.

Электроника также имеет высокое качество, и мы, как правило, имеем доступ к инженерам Bruker, которые расскажут вам детали, касающиеся необходимой вам электроники.

Кроме того, когда мы находимся в Бразилии, нам действительно необходимо это партнерство с компанией, которая в нашем случае гарантирует, что оборудование работает круглосуточно. Если вы инвестируете в спектрометр, вам нужно убедиться, что он будет работать круглосуточно, и за это несут ответственность не только менеджеры в центре ЯМР, но и команда технического обслуживания в Bruker.

Это партнерство и предоставляемая клиентская служба / техническая поддержка очень важны и должны быть учтены, прежде чем вы решите, у какой компании вы собираетесь приобрести спектрометр.

О Фабио Алмейде

<img alt=" Fabio BIO "src =" data: image / gif; base64, R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP /// yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7 "data-src =" / image.axd ?6 = 2% 2ff = картинка -2% 2jfj = ff = 2% 2jff = 201% jj "плавать: правильно; ширина: 180 пикселей; высота: 270 пикселей; поле слева: 10 пикселей; margin-right: 10px; "title =" Fabio BIO "class =" lazy-load-image "width =" 180 "height =" 270 "/>

Фабио С. Л. Алмейда является экспертом в области структуры и динамики белка методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Он открыл структуру нескольких белков методом ЯМР. Он также сделал множество важных открытий, касающихся структуры и динамики растительных дефензинов.

Фабио и его группа показали, что, несмотря на консервативное сворачивание, дефенсины демонстрируют широкий разброс в динамике, что позволило картировать области связывания и описать механизм распознавания мембран.

Группа также показала, что динамика также является ключом к пониманию механизма мембранного распознавания антимикробных пептидов. Предсуществующий порядок в гибких пептидах позволяет различать области специфического и неспецифического связывания.

Группа Фабио также описала структуру и динамику водной полости тиоредоксина, который является важным структурным элементом для катализа. Фабио является директором Национального центра ЯМР (CNRMN) и президентом Бразильской ассоциации ЯМР (AUREMN).

        
      

Source link