Общая аналогия редактирования генов CRISPR заключается в том, что он работает как молекулярные ножницы, вырезая избранные участки ДНК. Стэнли Ци, доцент кафедры биоинженерии в Стэнфордском университете, любит эту аналогию, но считает, что пора переосмыслить CRISPR как швейцарский армейский нож.
«CRISPR может быть таким же простым, как резак, или более продвинутым, как регулятор, редактор, этикетировщик или имидж-сканер. Многие приложения появляются в этой захватывающей области», – сказал Ци, который также является доцентом кафедры химии и технологий. системная биология в Стэнфордской школе медицины и научный сотрудник Стэнфордского института ChEM-H.
Множество различных систем CRISPR, которые используются или проходят клинические испытания для генной терапии заболеваний глаз, печени и мозга, однако, остаются ограниченными по своему охвату, потому что все они страдают одним и тем же недостатком: они слишком велики и, поэтому его слишком сложно доставить в клетки, ткани или живые организмы.
В статье, опубликованной 3 сентября в Molecular Cell Ци и его сотрудники объявляют о том, что, по их мнению, является важным шагом вперед для CRISPR: эффективный, многоцелевой, мини Система CRISPR. В то время как обычно используемые системы CRISPR – с такими названиями, как Cas9 и Cas12a, обозначающими различные версии CRISPR-ассоциированных (Cas) белков – состоят примерно из 1000-1500 аминокислот, их «CasMINI» содержит 529.
В ходе экспериментов исследователи подтвердили, что CasMINI может удалять, активировать и редактировать генетический код, как и его более мощные аналоги. Его меньший размер означает, что его будет легче доставлять в клетки человека и организм человека, что делает его потенциальным инструментом для лечения различных заболеваний, включая болезни глаз, дегенерацию органов и генетические заболевания в целом.
Настойчивые усилия
Чтобы сделать систему как можно меньше, исследователи решили начать с CRISPR-белка Cas12f (также известного как Cas14), поскольку он содержит всего около 400-700 аминокислот. Однако, как и другие белки CRISPR, Cas12f естественным образом происходит от архей – одноклеточных организмов, что означает, что он не очень хорошо подходит для клеток млекопитающих, не говоря уже о клетках или телах человека. Известно, что только несколько белков CRISPR работают в клетках млекопитающих без модификации. К сожалению, CAS12f не входит в их число. Это создает заманчивую задачу для таких биоинженеров, как Ци.
Мы думали: «Хорошо, миллионы лет эволюции не смогли превратить эту систему CRISPR во что-то, что функционирует в человеческом теле. Можем ли мы изменить это всего за один или два года? ' Насколько мне известно, мы впервые превратили неработающий CRISPR в рабочий ".
Стэнли Ци, доцент кафедры биоинженерии Стэнфордского университета
Действительно, Сяошу Сюй, научный сотрудник лаборатории Ци и ведущий автор статьи, не обнаружил активности природного Cas12f в клетках человека. Сюй и Ци предположили, что проблема заключалась в том, что ДНК генома человека более сложна и менее доступна, чем ДНК микробов, что затрудняет обнаружение Cas12f своей мишени в клетках. Глядя на предсказанную с помощью вычислений структуру системы Cas12f, она тщательно выбрала около 40 мутаций в белке, которые потенциально могли бы обойти это ограничение, и создала конвейер для одновременного тестирования множества вариантов белка. Теоретически рабочий вариант мог бы превратить человеческую клетку в зеленый цвет, активируя зеленый флуоресцентный белок (GFP) в ее геноме.
«Сначала эта система вообще не работала в течение года», – сказал Сюй. «Но после итераций биоинженерии мы увидели, как некоторые искусственно созданные белки начали включаться, как магия. Это заставило нас по-настоящему оценить силу синтетической биологии и биоинженерии»
Первые успешные результаты были скромными, но они взволновали Сюй и побудили ее двигаться вперед, потому что это означало, что система работает. В ходе многих дополнительных итераций ей удалось еще больше улучшить характеристики протеина. «Мы начали с того, что увидели только две клетки, показывающие зеленый сигнал, а теперь, после инженерии, почти каждая клетка под микроскопом становится зеленой», – сказал Сюй.
«В какой-то момент мне пришлось остановить ее», – вспоминал Ци. «Я сказал:« Пока все хорошо. Вы создали довольно хорошую систему. Мы должны подумать о том, как эту молекулу можно использовать для приложений »»
Помимо белковой инженерии, исследователи также создали РНК, которая направляет белок Cas к целевой ДНК. Модификации обоих компонентов имели решающее значение для работы системы CasMINI в клетках человека. Они протестировали способность CasMINI удалять и редактировать гены в лабораторных клетках человека, включая гены, связанные с ВИЧ-инфекцией, противоопухолевым иммунным ответом и анемией. Он работал почти со всеми генами, которые они тестировали, с устойчивыми ответами в нескольких.
Открытие двери
Исследователи уже начали налаживать сотрудничество с другими учеными для разработки генной терапии. Их также интересует, как они могут внести свой вклад в развитие РНК-технологий – например, то, что было использовано для разработки мРНК-вакцин против COVID-19, – где размер также может быть ограничивающим фактором.
«Эта способность конструировать эти системы была желательна в полевых условиях с первых дней CRISPR, и я чувствую, что мы сделали все, что в наших силах, чтобы приблизиться к этой реальности», – сказал Ци. «И этот инженерный подход может быть очень полезным. Это то, что меня волнует – открытие двери для новых возможностей»
Источник:
Ссылка в журнале:
Xu, X., et al. (2021) Разработана миниатюрная система CRISPR-Cas для регулирования и редактирования генома млекопитающих. Молекулярная ячейка. doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.008.