Исследовательская группа во главе с доктором Айсин ЯН, адъюнкт-профессором исследовательского отдела молекулярной и клеточной биологии факультета естественных наук, в сотрудничестве с почетным клиническим профессором Патриком Си Ву с кафедры микробиологии медицинского факультета Ли Ка Шинга, Университет Гонконга (HKU) сообщил о разработке переносимой и интегративной платформы на основе CRISPR I типа, которая может эффективно редактировать различные клинические изоляты Pseudomonas aeruginosa супербактерии, способной инфицировать различные ткани и органы. и главный источник внутрибольничных инфекций.

Этот метод может ускорить идентификацию детерминант резистентности патогенов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и разработку новых стратегий борьбы с резистентностью.

Исследование открыло новые возможности для геномного редактирования этих диких бактериальных видов и изолятов, таких как те, которые имеют клиническое и экологическое значение, и те, которые образуют микробиом человека. Он также предоставил основу для использования других систем CRISPR-Cas, широко распространенных в прокариотических геномах, и расширения наборов инструментов на основе CRISPR. Исследование было опубликовано в ведущем научном журнале Nucleic Acids Research .

Справочная информация

Система CRISPR-Cas включает в себя адаптивную иммунную систему прокариот, которая обезоруживает вторгшиеся вирусы, расщепляя их ДНК. Благодаря своей уникальной способности нацеливать и изменять последовательности ДНК, CRISPR-Cas используется как метод редактирования генома следующего поколения.

Метод основан на системе CRISPR / Cas9 класса 2 типа II, которая произвела революцию в генетике и биомедицинских исследованиях множества организмов и была удостоена Нобелевской премии по химии 2020 года. Однако системы CRISPR-Cas класса 2 представляют только ∼10% систем CRISPR-Cas, естественным образом кодируемых в прокариотах. Их приложения для редактирования бактериальных геномов довольно ограничены.

Примечательно, что системы CRISPR-Cas, принадлежащие к разным классам и типам, постоянно идентифицируются, и они служат глубоким резервуаром для расширения наборов инструментов на основе CRISPR. Самая разнообразная и широко распространенная система CRISPR-Cas – это система типа I, на которую приходится 50% всех идентифицированных систем CRISPR-Cas, и она имеет потенциал для расширения наборов инструментов на основе CRISPR с отличительными преимуществами, недоступными для систем класса 2, например высокая специфичность, минимальное отклонение от цели и возможность делеции больших фрагментов.

Однако система CRISPR-Cas типа I опирается на многокомпонентный эффекторный комплекс, называемый каскадом, для вмешательства в ДНК, которая не может быть легко передана гетерологичным хозяевам, что препятствует широкому применению этих широко распространенных в природе CRISPR для редактирования генома и терапии.

Основные выводы

Ранее группа определила высокоактивную систему CRISPR-Cas типа I-F в клинике с множественной лекарственной устойчивостью P. aeruginosa штамм PA154197, который был изолирован от случая инфекции кровотока в больнице Королевы Марии. Они охарактеризовали эту систему CRISPR-Cas и успешно разработали метод редактирования генома, применимый к изоляту MDR, на основе этой системы CRISPR-Cas нативного типа I-F. Этот метод позволил быстро идентифицировать детерминанты устойчивости клинического изолята МЛУ и разработать новую стратегию борьбы с резистентностью ( Cell Reports 2019, 29, 1707-1717).

Чтобы преодолеть барьер передачи комплексного каскада типа I гетерологичным хозяевам, в этом исследовании команда клонировала весь оперон типа IF cas в эффективный вектор интеграции mini-CTX и доставила кассету в гетерологичные хозяева путем конъюгации – распространенный в природе подход к переносу ДНК. Вектор mini-CTX обеспечил интеграцию всего Cascade в консервативный генетический локус attB в геноме гетерологичных хозяев, что позволило им нести систему IF CRISPR-Cas «нативного» типа, которая может быть стабильной выраженная и функция.

Команда показала, что IF Cascade переносимого типа демонстрирует значительно большую способность к интерференции ДНК и более высокую стабильность штаммов, чем переносимая система Cas9, и может использоваться для редактирования генома с эффективностью (> 80%) и простотой, т. ступенчатая трансформация единственной редактирующей плазмиды.

Кроме того, они разработали усовершенствованную переносимую систему, которая включает как высокоактивный каскад типа I-F, так и рекомбиназу, чтобы способствовать применению системы в штаммах с плохой гомологичной рекомбинационной способностью, диким P. aeruginosa без информации о последовательности генома, а также у других видов Pseudomonas

.

Наконец, введенные гены каскада типа I-F могут быть легко удалены из геномов хозяина посредством делеции больших фрагментов ДНК, опосредованной I-F каскадом, что приводит к безрубцовому редактированию генома в клетках-хозяевах. Также было продемонстрировано применение переносимой системы для репрессии генов, подчеркнув надежные и разнообразные применения разработанной системы CRISPR переносимого типа I-F

.

Д-р Айсин Ян предсказал, что этот новый метод будет распространен на редактирование не только патогенов, но и микробиома для улучшения здоровья человека.

Мы считаем, что технология и методы лечения на основе CRISPR принесут новые надежды в борьбе с супербактериями в будущем ».

Д-р Айсинь Ян, доцент, Исследовательский отдел молекулярной и клеточной биологии, факультет естественных наук Гонконгского университета

Source link