Исследователи разрабатывают синтетический дефектный геном SARS-CoV-2, который подавляет репликацию вируса

Исследователи разрабатывают синтетический дефектный геном SARS-CoV-2, который подавляет репликацию вируса

Более короткий геном, содержащий только часть генома РНК SARS-CoV-2, конкурирует с нормальным вирусом за рост и потенциально может предотвратить репликацию вируса.

Разрушительное воздействие пандемии коронавирусного заболевания 2019 г. (COVID-19), вызванной тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), привело к значительным усилиям по сдерживанию его передачи. Когда РНК-вирусы, такие как SARS-CoV-2, реплицируются, могут существовать версии вируса с большими делециями в вирусном геноме, что делает вирус дефектным. Эти дефектные геномы все еще могут реплицироваться в присутствии полноразмерного вируса. Поскольку они короче, они могут реплицироваться быстрее, чем исходный вирус, и конкурировать с полноразмерным вирусом за репликацию, нарушая рост и распространение вируса.

<img alt=" Трехмерный рендеринг микроба SARS-CoV-2 с молекулой РНК внутри. Изображение предоставлено: Vchal / Shutterstock "height =" 627 "src =" http://www.news-medical.net/image.axd?picture=2020%2f11%2fshutterstock_1670143177_(1).jpg "title =" 3D-рендеринг Микроб SARS-CoV-2 с молекулой РНК внутри. Изображение предоставлено: Vchal / Shutterstock "width =" 1200 "/>

Трехмерное изображение микроба SARS-CoV-2 с молекулой РНК внутри. Изображение предоставлено: Vchal / Shutterstock

Эти дефектные интерферирующие (DI) геномы обычны для коронавирусов, но DI для SARS-CoV-2 еще не зарегистрировано. Обычно считается, что частицы DI являются результатом неэффективной репликации или выполняют регуляторные функции. Исследователи из Университета штата Пенсильвания, США, разработали синтетическую конструкцию DI для SARS-CoV-2 и сообщили о своих результатах в новом исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv *

.

Синтетический дефектный интерферирующий геном

Они подготовили синтетические геномы DI из частей генома SARS-CoV-2 и проверили, могут ли геномы DI реплицироваться в клетках, инфицированных как синтетическим геномом, так и вирусом дикого типа (WT).

Они создали свою конструкцию с использованием трех частей вирусного генома: 5 'UTR и 5' части неструктурного белка 1 (nsp1) в ORF1a, части nsp15 с сигналом упаковки и последовательности 3'-часть последовательности N, ORF10 и 3'UTR. Синтетический геном DI имел длину 2882 нуклеотида (нт), что составляло около 9,6% от длины генома вируса WT. Кроме того, авторы также подготовили второй более короткий синтетический геном длиной около 800 нт без упаковочной части.

Команда подготовила два генома в виде ДНК и вставила их в плазмиды, транскрибируя их in vitro чтобы получить РНК. Полученные РНК вставляли в клетки Vero-E6, инфицированные SARS-CoV-2.

Поскольку синтетические геномы DI быстро разрушаются и плохо реплицируются, авторы не смогли изучить, как они реплицируются. Однако геном DI с тремя частями снижал репликацию SARS-CoV-2 примерно наполовину через 24 часа после трансфекции. Более короткий геном DI не оказал никакого влияния на рост SARS-CoV-2.

<img alt=" DI снижает количество SARS-CoV-2 вдвое; реплицируется в 3 раза быстрее; и передается с такой же эффективностью. Желтый: DI при коинфекциях; синий: WT при коинфекциях; серый: WT при инфекциях без DI. а: Темпы роста (абсолютное количество по отношению к количеству через 4 часа) WT в контроле и при коинфекции; рост относительно контроля в тот же момент времени; и детали в 24 часа. b: через 24 часа после заражения супернатант использовали для заражения новых клеток. Эффективность передачи – это количество, измеренное с помощью qRT-PCR непосредственно перед пассацией, деленное на среднее количество, измеренное почти сразу (4 часа) после пассажа. c: Темпы роста (абсолютное количество по отношению к количеству через 4 часа) WT в контроле и при коинфекции; рост относительно контроля в тот же момент времени; и детали в 24 часа. Темпы роста (абсолютная величина по отношению к сумме за 4 часа) WT и DI при коинфекциях; рост относительно WT при коинфекциях в тот же момент времени; и детализация в 24 часа. "height =" 971 "src =" http://www.news-medical.net/image.axd?picture=2020%2f11%2f2020.11.22.393587v1_222222222_-_1200_width.jpg "title =" DI снижает количество SARS-CoV-2 вдвое; реплицируется в 3 раза быстрее; и передается с такой же эффективностью. Желтый: DI при коинфекциях; синий: WT при коинфекциях; серый: WT при инфекциях без DI. а: Темпы роста (абсолютное количество по отношению к количеству через 4 часа) WT в контроле и при коинфекции; рост относительно контроля в тот же момент времени; и детали в 24 часа. b: через 24 часа после заражения супернатант использовали для заражения новых клеток. Эффективность передачи – это количество, измеренное с помощью qRT-PCR непосредственно перед пассацией, деленное на среднее количество, измеренное почти сразу (4 часа) после пассажа. c: Темпы роста (абсолютное количество по отношению к количеству через 4 часа) WT в контроле и при коинфекции; рост относительно контроля в тот же момент времени; и детали в 24 часа. Темпы роста (абсолютная величина по отношению к сумме за 4 часа) WT и DI при коинфекциях; рост относительно WT при коинфекциях в тот же момент времени; и детализация в 24 часа. "width =" 1200 "/>

DI снижает количество SARS-CoV-2 вдвое; реплицируется в 3 раза быстрее; и передается с такой же эффективностью. Желтый: DI при коинфекциях; синий: WT при коинфекциях; серый: WT при инфекциях без DI. а: Темпы роста (абсолютное количество по отношению к количеству через 4 часа) WT в контроле и при коинфекции; рост относительно контроля в тот же момент времени; и детали в 24 часа. b: через 24 часа после заражения супернатант использовали для заражения новых клеток. Эффективность передачи – это количество, измеренное с помощью qRT-PCR непосредственно перед пассацией, деленное на среднее количество, измеренное почти сразу (4 часа) после пассажа. c: Темпы роста (абсолютное количество по отношению к количеству через 4 часа) WT в контроле и при коинфекции; рост относительно контроля в тот же момент времени; и детали в 24 часа. Темпы роста (абсолютная величина по отношению к сумме за 4 часа) WT и DI при коинфекциях; рост относительно WT при коинфекциях в тот же момент времени; и детализация в 24 часа.

Через день после трансфекции команда заразила новые клетки, используя супернатант. И вирус WT, и геном DI наблюдались через четыре часа после заражения, но они не видели геном DI без упаковочной части. Не было разницы в скорости передачи генома DI и вируса WT, что позволяет предположить, что более короткий геном DI столь же заразен, как вирус WT.

В образцах, инфицированных как геномом DI, так и обычным вирусом, количество обычных вирионов уменьшилось вдвое за 24 часа. Геном DI увеличивался примерно в три раза быстрее, чем вирус WT. Результаты показывают, что даже небольшое количество генома DI может сильно повлиять на репликацию вируса WT.

Дефектный геном конкурирует с нормальным вирусом во время роста

Авторы также смоделировали динамику системы, чтобы понять внутриклеточную конкуренцию между геномом DI и нормальным вирусом. Подобно предсказаниям из предыдущих моделей, геном DI и вирус WT сосуществуют, если преимущество репликации генома DI ниже критического порога. Выше этого порога геномы DI убивают все вирусы WT. Этот порог зависит от количества геномов в пределах диапазона вирусного белка, продуцируемого обычным вирусом.

Таким образом, модель предполагает, что геном DI со временем будет увеличиваться и убивать геном вируса WT. Однако, поскольку авторы измерили только пять пассажей, в которых они действительно увидели увеличение отношения генома DI к WT, они пишут, что не смогли проверить, приведет ли это раннее уменьшение к исчезновению вируса WT.

«Вмешательство в вирус WT – самый замечательный эффект нашей конструкции DI», – пишут авторы. Частицы DI не служат никакой цели для вируса WT; скорее, они существуют как паразиты нормального вируса. Поскольку при совместной инфекции с вирусом они могут реплицироваться быстрее, чем полноразмерный вирус, они подходят в качестве потенциальных противовирусных средств.

По мере продолжения репликации частота генома DI продолжает увеличиваться, и процесс становится более эффективным, что в конечном итоге приводит к гибели как нормального вируса, так и генома DI. Хотя конструкции DI обладают потенциалом в качестве противовирусных средств, они мало изучены. ВИЧ и вирусы гриппа не являются идеальными кандидатами для этого подхода, поскольку у них короткие геномы и сложные жизненные циклы. Однако коронавирусы идеально подходят для этого подхода, поскольку они имеют длинный геном одноцепочечной РНК и простые жизненные циклы и могут быть дополнительно изучены на предмет SARS-CoV-2.

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.

Source link

Related Articles.