В начале пандемии коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19) было ясно, что необходимы быстрые и точные диагностические методы для борьбы с возникающими инфекциями и нейтрализации негативных последствий блокировок. С этой целью несколько лабораторий и предприятий по всему миру выделили ресурсы на разработку быстрых и недорогих диагностических технологий.

<img alt=" Исследование: Недорогое и колориметрическое обнаружение РНК с помощью платформы для бесклеточного синтеза белка E. coli при комнатной температуре. Кредит изображения: Orpheus FX / Shutterstock "class =" Round-img "height =" 800 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/images/news/ImageForNews_698577_16388068522116659.jpg "title =" Исследование: Недорогое и колориметрическое исследование. обнаружение платформой для бесклеточного синтеза белка E. coli при комнатной температуре. Изображение предоставлено: Orpheus FX / Shutterstock "width =" 1200 "/> ] Исследование: Недорогое и колориметрическое обнаружение РНК платформой для бесклеточного синтеза белка E. coli при комнатной температуре. Изображение предоставлено: Orpheus FX / Shutterstock

В этом контексте платформы для бесклеточной экспрессии белка (CFPS) стали привлекательными технологиями из-за их простоты использования, низкой стоимости и легкости разработки. Более того, бесклеточное биопроизводство стало возможным благодаря сублимационной сушке бесклеточных компонентов и их регидратации водными образцами. Была проделана большая работа по адаптации платформ CFPS для эффективного обнаружения вирусов, особенно с использованием нуклеаз CRISPR / Cas.

Ресурсы могут стать дефицитными и ограниченными во время непредвиденных мировых пандемий. Если для скрининга всего населения требуется крупномасштабное масштабирование диагностики, использование коммерческих источников реагентов может серьезно ограничить диагностические возможности. Борьба с высокоинфекционным респираторным вирусом требует всемирной стратегии, поскольку развивающиеся штаммы коронавируса 2 (SARS-CoV-2) тяжелого острого респираторного синдрома все время напоминают нам

.

Чтобы помочь нам в достижении этой цели, нам нужны доступные и недорогие диагностические технологии, которые легко внедрить и которые доступны по цене, особенно в развивающихся странах. Помня об этих стратегических целях, авторы этого исследования представляют потенциал для обнаружения вирусных последовательностей РНК с использованием перепрофилированной системы бесклеточной транскрипции / трансляции E. coli с колориметрическим выводом.

Риборегуляторные элементы, опосредованные переключателем пальцев ног, были приняты исследователями из Университета Тренто и Университета Альберты для активации экспрессии генов, которой предшествует изотермическая амплификация РНК, чему способствует тепло тела. Высокие аттомолярные (около 110 мкМ) концентрации вирусной РНК были идентифицированы из синтетических образцов с использованием минимального оборудования и бесклеточных процессов, работающих при комнатной температуре. Колориметрический результат был получен путем дополнения фрагмента α-галактозидазы аналогом X-gal, который служил изменяющим цвет субстратом с ферментативной активностью. Колориметрическая диагностическая платформа теоретически может быть связана с выделением РНК с помощью магнитных шариков, а слюна служит подтверждением концепции. Общая стоимость колориметрического анализа оценивается примерно в 0,72 евро за тест.

Препринтная версия исследования доступна на сервере medRxiv *, пока статья проходит рецензирование.

Исследование

Если приборы недоступны, для работы на месте (POC) и недорогих диагностических устройств могут потребоваться только операции при комнатной температуре. Бесклеточные условия реакции и процедуры приготовления экстракта были исследованы для обработки при комнатной температуре. После выращивания после лог-фазы при 23 ° C получали экстракты E. coli. По сравнению с обычным ростом при 37 ° C экстракты E. coli сохранили 50% своей активности. Функциональность бесклеточных процессов была исследована и подтверждена без сублимационной сушки, но только после сушки, чтобы не полагаться на дорогостоящие инструменты.

Теоретически исследователи могут отказаться от дорогостоящего оборудования для сублимационной сушки, чтобы таким способом проводить лиофилизированные бесклеточные реакции. Наконец, POC-диагностика может использовать одностадийную инактивацию вирусов из физиологических жидкостей с последующими бесклеточными реакциями. С этой целью была исследована совместимость бесклеточных реакций со слюной человека.

Следуя этим усилиям по оптимизации бесклеточного экстракта, авторы разработали бесклеточные совместимые методы изотермической амплификации РНК. Для проверки этой гипотезы были использованы процедуры амплификации на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), амплификации полимеразы с обратной транскриптазой и рекомбиназой (RT-RPA) и амплификации по катящемуся кругу с обратной транскриптазой (RT-RCA). RT-RPA оказался наиболее эффективным методом преамплификации как при рекомендуемых температурах, так и при 30 ° C.

Реакции NASBA, которые могут быть сконструированы собственными силами и использоваться в высокопроизводительной диагностике, основанной на секвенировании, были выбраны в качестве объекта исследования. Цель заключалась в том, чтобы уменьшить зависимость диагностических инструментов от коммерческих компонентов и наборов, которых было мало в первые дни вспышки COVID-19.

Ранее было показано, что «незанятая» РНК-полимераза бактериофага Т7 (РНКП Т7) вызывает транскрипцию случайных, неспецифических дуплексов РНК. Чтобы решить эту проблему, к смеси был добавлен случайный олигонуклеотидный дуплекс ДНК для уменьшения неспецифической транскрипции T7 RNAP. Условия реакции NASBA дополнительно оценивали при комнатной температуре с уменьшением концентрации фермента.

Однако ни один из подходов, включая RT-RPA, не позволял эффективно амплифицировать РНК при температуре окружающей среды. С другой стороны, условия для оптимальной активности фермента на этапах преамплификации способствовали гипотетическому лизису человеческих клеток в одном сосуде и экстракции вирусных частиц. Добавление 0,5% (об. / Об.) Triton X-100 к реакционной смеси NASBA увеличивало эффективность амплификации в сочетании с буфером для лизиса. Тем не менее, как «готовый к использованию» реагент, процесс лизиса клеток из слюны человека не перекрывался с амплификацией РНК в реакции NASBA.

Последствия

Зависимость бизнеса от реакции RT-RPA, по-видимому, на данный момент является наиболее значительным ограничивающим фактором. Тем не менее, по сравнению с оценками, небольшие объемы RT-RPA и будущие усилия по расширению масштабов экстрактов E. coli могут снизить затраты на анализы до 50%.

Авторы были рады упомянуть, что колориметрическое обнаружение может быть интегрировано в приложения сотовых телефонов или носимые устройства, что позволяет нам использовать бесклеточную синтетическую биологию в нашей повседневной жизни. Эта работа еще раз подчеркнула клинический и трансляционный потенциал бумажных биосенсоров, поскольку упомянутые ограничения были устранены и были проведены исследования по оптимизации.

* Важное примечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие в клинической практике / поведении, связанном со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.