Коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19) вызывается тяжелым острым респираторным синдромом, коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), который является высоковирулентным вирусом. Данные свидетельствуют о том, что нарушение вирусами эпигенетических путей хозяина происходит по механизму имитации белков клетки-хозяина, особенно гистонов. Гистоны связываются с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) в ядре и впоследствии способствуют ее конденсации с образованием хроматина.

Гистоны подвергаются различным посттрансляционным модификациям (PTM), которые играют роль в регуляции экспрессии генов в клетке. Мимикрия гистонов – это механизм, посредством которого вирусы нарушают регуляцию экспрессии гена хозяина, тем самым нарушая ответ хозяина на инфекцию.

Недавнее исследование, опубликованное на сервере препринтов bioRxiv * исследует мимикрию гистонов как механизм, используемый SARS-CoV-2 для нарушения эпигенетической регуляции, чтобы избежать ответа клетки-хозяина на инфекцию.

Исследование: Белок, кодируемый SARS-CoV-2 ORF8, содержит миметик гистона, нарушает регуляцию хроматина и усиливает репликацию. Изображение предоставлено: CROCOTHERY / Shutterstock.com

Соответствующие области, идентифицированные между Orf8 и аминоконцевым хвостом гистона H3

Ученые, участвовавшие в этом исследовании, провели биоинформатическое сравнение вирусных белков SARS-CoV-2 с белками гистонов человека, чтобы определить, используется ли мимикрия гистонов SARS-CoV-2 во время инфекции. Они идентифицировали соответствие между областями в белке, кодируемом ORF8 (Orf8), и в аминоконцевом хвосте гистона H3. Примечательно, что Orf8 выравнивается с длинным отрезком из шести идентичных и последовательных аминокислот.

Область гистона, которая совпадает с Orf8, содержит последовательность «ARKS», которая является критической регуляторной областью в гистоне H3 и присутствует в двух разных сайтах на гистоновом хвосте. Сайты ARKS подвергаются посттрансляционным модификациям, таким как метилирование и ацетилирование по H3 лизину 9 (H3K9me3 и H3K9ac) и H3 лизину 27 (H3K27me3 и H3K27ac).

Кроме того, данные образцов пациентов показывают, что транскрипт ORF8 высоко экспрессируется в течение 24 часов после заражения SARS-CoV-2 по сравнению с транскриптами гистона H3. Orf8 может действовать как имитатор гистонов и прерывать регуляцию в сайтах ARKS, присутствующих на гистоне H3, тем самым способствуя патогенности SARS-CoV-2.

Orf8 может функционировать как имитатор гистонов

Исследования in vitro были выполнены для оценки внутриклеточной локализации Orf8. Было замечено, что Orf8 локализуется в цитоплазме на периферии ядра и совместно локализуется с LaminB1 и LaminA / C, которые являются ядерными белками. Исследования клеточного фракционирования дополнительно подтвердили присутствие Orf8 как в цитоплазме, так и в ядре.

Ученые также исследовали связывание Orf8 с хроматином путем увеличения концентрации соли. Впоследствии Orf8, ламин и гистоны диссоциировали от хроматина при одинаковых концентрациях соли.

Делеция мотива ARKSAP из сайта, имитирующего гистон, влияет на силу связывания Orf8, отсутствие которого делает возможной диссоциацию при более низких концентрациях соли. Иммунопреципитация хроматина с высокопроизводительным секвенированием ДНК (ChIP-seq) была проведена и показала, что Orf8 ассоциируется с хроматином и обнаруживается в областях генома, которые содержат H3K27me3 и H3K9me2.

Эксперименты по иммунопреципитации были проведены для идентификации конкретных белков, которые связываются с Orf8. Было обнаружено, что Orf8 коиммунопреципитируется с LaminB1, гистоном H3 HP1a и с гистон-модифицирующим ферментом ацетилтрансферазой KAT2A / GCN5, который действует на H3K9, присутствующий в мотиве ARKS в гистоне H3. Дальнейшие исследования с использованием масс-спектрометрии показали, что Orf8 также связывается с белком, подобным фактору смертности 4 (MORF4L), который представляет собой комплексный белок гистонацетилтрансферазы (HAT), белками цинковых пальцев и с фактором транскрипции SP2.

Также была проведена жидкостная хроматография с последующей масс-спектрометрией с параллельным мониторингом реакции (LC-PRM-MS). Эти эксперименты показали, что остаток лизина, присутствующий на сайте имитации гистона ARKS, ацетилирован в Orf8, что предполагает возможность того, что часть Orf8 может существовать в виде мономера в клетках. Кроме того, помимо связывания с ферментами, модифицирующими гистоны, такими как ацетилтрансфераза KAT2A, Orf8 также претерпевает изменения, аналогичные гистону H3 этими ферментами.

Результаты этих исследований показывают, что Orf8 локализуется в ядерной пластинке и ассоциируется с хроматином и модифицирующими гистоны ферментами, такими как KAT2A, тем самым подтверждая, что Orf8 может функционировать как миметик гистона.

Orf8 разрушает посттрансляционные модификации гистона H3

Ученые далее исследовали, нарушает ли Orf8 регуляцию хроматина. Они провели исследования in vitro с клетками эмбриональной почки человека (HEK), трансфицированными Orf8, с последующей беспристрастной масс-спектрометрией для обнаружения посттрансляционных модификаций гистонов.

Эти исследования показали, что в клетках, экспрессирующих белок Orf8, модификации гистонов, которые способствовали экспрессии гена, ингибировались, в то время как те, которые способствовали уплотнению хроматина, что приводило к репрессии транскрипции, были увеличены. Примечательно, что гистоновые модификации в мотиве ARKS были ингибированы.

Интересно, что пептиды, содержащие посттрансляционные модификации H3K9ac и H3K14ac, которые способствуют экспрессии генов, были уменьшены. Кроме того, наблюдалось увеличение количества пептидов, имеющих метильные модификации H3K9 (H3K9me2 и H3K9me3) и метилирование H3K27 (H3K27me3 и H3.3K27me3). Эти данные также подтверждают, что Orf8 является имитатором гистонов и может нарушать регуляцию PTM на важных участках гистона.

Иммунофлуоресцентная визуализация клеток HEK, экспрессирующих Orf8, показала повышенные уровни H3K9me3 и H3K27me3 и пониженные уровни H3K9ac. Эксперименты с делеционными конструкциями Orf8, которые не содержат сайт миметика гистона ARKSAP (Orf8 ^{D ARKSAP} ), показали, что он не влияет на H3K9me3 или H3K27me3. Кроме того, эта делеция оказала незначительное влияние на H3K9ac, что позволяет предположить, что этот сайт важен для нарушения регуляции PTM с помощью Orf8.

Приобретенная мутация S84L (Orf8 ^S84L ) была обнаружена в Orf8 из штаммов SARS-CoV-2. Также было обнаружено, что Orf8 ^S84L действует аналогично немутированной версии Orf8, увеличивает H3K9me3 или H3K27me3 и уменьшает H3K9ac. Эти наблюдения предполагают, что эта мутация не влияет на функцию Orf8 по нарушению PTM.

Также были исследованы изменения экспрессии генов, вызванные Orf8 и Orf8 ^{D ARKSAP} и наблюдались различия в экспрессии групп генов в случае Orf8 и Orf8 ^{D АРКСАП} . Кроме того, было обнаружено, что Orf8 снижает экспрессию генов, связанных с регуляцией ДНК и сигнальными путями клеток.

Orf8 разрушает модификации гистонов во время заражения SARS-CoV-2

Было проведено несколько экспериментов с SARS-CoV-2 дикого типа и рекомбинантным мутантом SARS-CoV-2 с удаленным Orf8 (SARS-CoV-2 ^{D ORF8} ). Клетки A549 ^ACE сверхэкспрессирующие рецепторы ангиотензинпревращающего фермента (ACE), были инфицированы SARS-CoV-2 или SARS-CoV-2 ^{D ORF8} .

В клетках, инфицированных SARS-CoV-2, наблюдалось увеличение H3K9me3 и H3K27me3 и снижение H3K9ac. Этот эффект не наблюдался в клетках, инфицированных SARS-CoV-2 ^{D ORF8} что позволяет предположить роль Orf8 в дисрегулируемом гистоне PTM

.

Кроме того, уплотнение хроматина, приводящее к снижению доступности хроматина, наблюдаемое в случае SARS-CoV-2 дикого типа, отсутствовало в случае SARS-CoV-2 ^{D ORF8} . Это наблюдение подтверждает роль Orf8 в нарушении модификаций гистонов во время инфекции SARS-CoV-2.

Результаты этого исследования были дополнительно подтверждены анализом посмертных образцов легких трех пациентов с COVID-19. Клетки окрашивали для выявления присутствия нуклеокапсидного белка H3K9me3 и SARS-CoV-2, который позволяет идентифицировать инфицированные клетки.

Инфицированные клетки проявляли повышенное окрашивание на H3K9me3 по сравнению с неинфицированными клетками и контрольными тканями. Хотя размер выборки в этом анализе невелик, результаты свидетельствуют о нарушении регуляции ПТМ гистонов у пациентов с COVID-19 с тяжелым заболеванием.

Дальнейшие эксперименты с индуцированными человеческими плюрипотентными стволовыми клетками легких альвеолярного типа 2 (iAT2) подтвердили, что Orf8 увеличивает репликацию вируса в этих клетках.

Orf8 вызывает репрессию транскрипционных изменений в организме хозяина, возникающих в ответ на инфекции SARS-CoV-2

Была исследована роль Orf8 в транскрипционных изменениях, вызванных инфекцией SARS-CoV-2. Аденокарциномные альвеолярные базальные эпителиальные клетки человека, экспрессирующие высокие уровни рецептора АПФ (A549 ^ACE ), были инфицированы SARS-CoV-2 или SARS-CoV-2 ^{D ORF8} и RNA-seq выполняли после инфицирования для обнаружения изменений транскрипции.

В клетках, инфицированных SARS-CoV-2 дикого типа, уровни транскрипта Orf8 оказались выше, чем транскрипты белков человека. Клетки, инфицированные SARS-CoV-2 ^{D ORF8} показали высокие уровни дифференциально экспрессируемых генов по сравнению с инфицированными клетками дикого типа.

Это указывает на то, что Orf8 репрессирует транскрипционные изменения, происходящие в ответ на инфекцию, особенно на ранней стадии инфекции. Кроме того, в клетках, инфицированных SARS-CoV-2 ^{D ORF8} наблюдалась повышенная транскрипция таких генов, как гены ответа на интерферон и гены, кодирующие цитокины, которые играют роль в ответе клетки-хозяина. .

Заключение

В предыдущих отчетах от 2020 года говорится, что пациенты, инфицированные SARS-CoV-2 с делецией в ORF8, демонстрировали лучшие иммунные ответы и результаты для здоровья. Результаты этого исследования показывают, что Orf8 нарушает эпигенетические изменения за счет мимикрии гистонов, тем самым предполагая молекулярный механизм роли Orf8 в инфекциях SARS-CoV-2.

Настоящее исследование демонстрирует мимикрию гистонов как механизм, посредством которого SARS-CoV-2 нарушает эпигенетическую регуляцию, что приводит к подавлению реакции хозяина на инфекцию. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить, могут ли препараты, нацеленные на эпигенетические пути, влияющие на инфекцию SARS-CoV-2, оказаться полезными для пациентов с COVID-19.

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.