Новая методика редактирования генов, основанная на CRISPR, была использована для успешного предотвращения развития заболевания печени, которое может быть вызвано сотнями мутаций, а также для облегчения симптомов у мышей. Это исследование концепции было опубликовано в Интернете в журнале Science Advances в феврале 2020 года.

Фон

Метод CRISPR является модификацией предыдущего метода, разработанного исследователями в том же учреждении, для устранения только одного генетического дефекта. Исследователи адаптировали оригинальный метод для коррекции генетического состояния, вызванного дефицитом ключевого фермента орнитин-транскарбамилазы (ОТС).

Дефицит ОТС встречается примерно у 1 из 40 000 младенцев, родившихся живыми, и может быть вызван более чем 300 различными мутациями гена ОТС, расположенного на Х-хромосоме. OTC необходим для нормального функционирования цикла мочевины.

Цикл мочевины представляет собой процесс из 6 ферментов, который превращает токсичный аммиак в менее токсичную мочевину. Дефект в любом из этих ферментов приводит к накоплению аммиака в крови и, следовательно, в мозг. Этот токсин вызывает повреждение чувствительных нервных клеток мозга и может даже убить пациента.

Поскольку Х-хромосома присутствует только в одной копии у мужчин, дефект становится очевидным при рождении, в основном у мужчин. У самок 2 Х хромосомы, поэтому, если оба не несут дефекта этого гена, это состояние клинически не проявляется. Вместо этого самка с дефектом только одного из двух генов OTC становится носителем и может передать дефект половине своего потенциального потомства. Другие мутации в том же гене вызывают различные другие генетические условия.

Исследование

Раннее лечение имеет важное значение при большинстве генетических заболеваний из-за типично раннего проявления аномалии, которая может препятствовать нормальному развитию. Современные методы лечения направлены на очистку от аммиака другими путями, которые стимулируются лекарствами. Если дефект очень серьезный, может потребоваться пересадка печени. С другой стороны, слишком многие из этих пациентов умирают, и врачи, которые видят это состояние, часто постоянно ищут улучшенное лечение.

Техника

Более ранняя методика была слишком специфичной для лечения этого заболевания, при котором может присутствовать любая из более чем 300 мутаций. Поэтому команда сосредоточилась на разработке редактора генома с более широкой областью применения. Это основано на введении минигена или набора инструкций по кодированию белка в клетки печени с помощью вирусного вектора, называемого аденоассоциированным вирусом (AAV). Миниген не изменяет дефектную часть гена, но добавляет новый набор инструкций с помощью подхода типа «вырезай и вставляй».

Для этого они сначала создали специальный двойной вектор AAV, который содержал Cas9, бактериальный белок, который управляется РНК для быстрой идентификации и редактирования генов в клетках. Этот новый вектор называется AAV8, и он явно мигрирует к клеткам печени. Второй AAV имеет миниген, который содержит донорскую ДНК, кодирующую фермент ОТС человека. Этот функциональный миниген регулируется промоторной последовательностью, специфичной для клеток печени. Эта гарантия гарантирует, что он будет экспрессироваться только в клетках печени после введения в кровь через AAV.

Cas9 сначала врезает цепь ДНК в сайт-мишень в последовательности гена. Это «вырезанная» часть процесса, за которой следует «паста», где миниген добавляется посредством процесса восстановления, называемого гомологичным ремонтом.

Добавление позволило новорожденным мышам развиваться гораздо более здоровым образом. Через три недели жизни 25% клеток печени экспрессировали безрецептурные препараты, а через 8 недель 35% демонстрировали эту экспрессию. Это может показаться небольшим отличием, но оно все еще в три и четыре раза превышает эффект, вызванный использованием нецелевого вектора в эти моменты времени, соответственно.

Когда в эти моменты времени исследовали печень, исследователи обнаружили, что кластеры OTC-продуцирующих клеток расположены по всей печени более или менее равномерно. Разница сохранилась во взрослой жизни. Даже на диете с высоким содержанием белка у мышей-мишеней уровень аммиака был на 60% ниже, чем у необработанных мышей.

Последствия

Разница объясняется другим исследователем, Лили Ванг: «В отличие от других подходов CRISPR, которые удаляют или модифицируют часть нормального гена, этот метод объединяет новую часть. Мы не пытаемся исправить мутации, которые мешают клеткам печени производя OTC; мы добавляем этот новый миниген, чтобы клетки могли. "

Исследование показывает, что этот новый метод на основе CRISPR может быть адаптирован для предотвращения клинических проявлений редкого генетического состояния, вызванного множественными мутациями. Это может также использоваться, чтобы облегчить другие наследственные условия, вызванные другими мутациями того же самого гена. Критическая особенность этого подхода заключается в том, что он использует одну стратегию для борьбы с состоянием, вызванным рядом мутаций в разных частях генома, а не только одной главной мутацией.

Исследователь Джеймс Уилсон объясняет: «Здесь мы продвинули подход CRISPR вперед, чтобы не только поддерживать экспрессию OTC в клетках, но и расширять возможности инструмента. Мы приблизились к потенциальному подходу к редактированию генов с широким спектром». для лечения пациентов с дефицитом OTC, независимо от мутации и клинического состояния. Следующим этапом, посредством дополнительных доклинических исследований, является поиск безопасного порта для гена в клетках печени человека, а затем проверка аналогичного подхода к редактированию генов ».