Молекулярные биологи разрабатывают трубопровод для создания и скрининга новых пептидов лантибиотиков

        

Природа предоставила нам много противомикробных препаратов. Однако, учитывая быстрое повышение устойчивости к противомикробным препаратам, существует необходимость в разработке новых для природы антибиотиков. Лантибиотики – интересный вариант. Молекулярные биологи из Университета Гронингена и их коллеги в Швейцарии и Германии в настоящее время разработали трубопровод для создания и скрининга большого количества новых пептидов лантибиотиков. Описание метода и первые результаты были опубликованы 1 апреля в журнале Nature Chemical Biology .

Лантибиотические пептиды модифицируют после того, как они продуцируются рибосомами. Ферменты могут связывать различные аминокислоты в пептидной цепи с образованием колец. Хорошо известным лантибиотиком является низин, пептид с пятью кольцами, который используется в качестве консерванта в пищевой промышленности. «Существуют разные аминокислотные последовательности, из которых состоят кольца», – объясняет профессор молекулярной биологии Оскар Кейперс из Университета Гронингена. «Мы знаем, что выбор из 12 натуральных лантибиотиков имеет разные комбинации».

Синтетические гены

Кейперс и его коллеги из ETH Zürich (Швейцария) и Университета Регенсбурга (Германия) разработали систему для создания большого количества новых лантибиотиков: «Мы синтезировали нити ДНК, кодирующие различные кольца, и объединили эти генетические модули с образованием лантибиотика гены, кодирующие случайные комбинации пяти колец. ' Созданная ими библиотека генов содержала около 14 000 синтетических генов.

Следующим шагом было обследование генных продуктов на антимикробный потенциал. Для этого они модифицировали методику, разработанную для скрининга ферментов, на основе микроальгинатных гранул. Внутри этих шариков – каждый около 70 микрометров в диаметре – могут расти бактерии. Гены из библиотеки помещали в штамм-продуцент, содержащий красный флуоресцентный маркер. «Мы разводили эти бактерии, чтобы в итоге получалась одна или ноль клеток на шарик. Мы также добавили целевой штамм, который мог быть убит лантибиотиками; эти клетки использовались в более высокой концентрации – около 50 на шарик ». Клетки-мишени имели зеленый флуоресцентный маркер и продуцировали пептидазу, которая активировала предшественник лантибиотиков, секретируемых клетками-продуцентами.

Скрининг

Когда шарики инкубировали, штамм-продуцент образовывал внутри одну колонию, секретируя лантибиотики. Эти пептиды не могли покинуть шарики. Количество зеленых колоний, растущих внутри каждой бусинки, отрицательно коррелировало с антимикробным эффектом активированных лантипептидов. Используя флуоресцентный сортировщик клеток, предназначенный для частиц, можно было отфильтровывать 50 000 шариков в час и отбирать шарики с низким уровнем зеленой флуоресценции.

Но этот показ ни в коем случае не был концом работы, которую нужно было сделать. Следующим этапом было выделение колоний-продуцентов из отобранных гранул, которые показали сильный антимикробный эффект. Это было просто; однако точная характеристика образовавшегося продукта оказалась сложной из-за низкого уровня производства внутри шарика. «Сначала нам пришлось выращивать их в больших количествах, прежде чем мы смогли проанализировать произведенный лантибиотик». Еще одним осложнением было то, что ферменты, продуцирующие кольца, не работали с идеальной точностью. «Даже в одной колонии, где все клетки имеют одинаковую ДНК, может быть получено до пяти или шести различных лантипептидов».

Рациональный дизайн

В конце, серия лантипептидов с сильным антимикробным эффектом была выделена и охарактеризована. «Мы обнаружили пептиды с различной активностью антибиотиков, хотя некоторые пептиды выглядели немного как низин или эпидермин. Оказалось, что мы даже воссоздали низин в нашей генной библиотеке. Эксперимент предоставил много информации о структурно-функциональных отношениях различных колец в лантибиотических пептидах. Теперь это можно использовать для рационального подхода к разработке новых антибиотиков.

Второй вывод из исследования заключается в том, что конвейер – от создания библиотеки генов до скрининга и определения характеристик – работает очень эффективно. Следующим шагом является использование настоящего патогена в качестве репортерного штамма вместо клеток Lactococcus, использованных в первом раунде. «И сейчас мы работаем над созданием пептидов с одним кольцом. Пептиды с пятью кольцами, которые мы произвели в этом исследовании, слишком велики для фармацевтического применения. Многие антибиотики напоминают структуру с одним кольцом, похожую на ванкомицин ». Эти антибиотики производятся путем специфической ферментативной связи аминокислот, тогда как лантибиотики производятся из генов рибосомами. «Это означает, что мы можем использовать быстрые методы молекулярной биологии для создания и скрининга больших библиотек».

Источник:

https://www.rug.nl/sciencelinx/nieuws/2019/04/20190401_kuipers

      

Source link