В новом ресурсе для научного сообщества, опубликованном сегодня в Nature Biotechnology исследователи из лаборатории Невилла Санджаны, доктора философии, Нью-Йоркского центра генома (NYGC) и Нью-Йоркского университета (NYU) разработал CRISPR-sciATAC, новую интегративную платформу генетического скрининга, которая совместно фиксирует нарушения генов CRISPR и доступность одноклеточного хроматина по всему геному.

С помощью этой технологии они профилируют изменения в организации генома и создают крупномасштабный атлас того, как потеря отдельных ферментов, изменяющих хроматин, влияет на геном человека. Новый метод использует программируемость системы редактирования генов CRISPR для параллельного нокаута почти всех связанных с хроматином генов, предлагая исследователям более глубокое понимание роли доступности ДНК при раке и редких заболеваниях, связанных с хроматином.

Последние достижения в одноклеточных технологиях дали ученым возможность профилировать хроматин, комплекс ДНК и белков, который находится в ядрах отдельных клеток. Хроматин часто называют «привратником» генома, потому что его белки действуют как упаковочные элементы для ДНК, либо способствуя доступу к нему, либо отказывая ему в доступе

.

Это контролирует процессы экспрессии генов в клетке, такие как включение или выключение определенных генов. Изменения в ландшафте хроматина были связаны с различными человеческими особенностями и заболеваниями, в первую очередь с раком.

При первоначальной демонстрации CRISPR-sciATAC команда Sanjana Lab разработала библиотеку CRISPR для нацеливания на 20 генов, модифицирующих хроматин, которые обычно мутируют при различных формах рака, включая рак груди, толстой кишки, легких и мозга.

Многие из этих ферментов действуют как опухолевые супрессоры, и их потеря приводит к глобальным изменениям доступности хроматина. Например, группа показала, что потеря гена EZH2, который кодирует гистоновую метитрансферазу, привела к увеличению экспрессии генов в нескольких ранее заглушенных генах развития.

Масштаб CRISPR-sciATAC делает этот набор данных очень уникальным. Здесь, на единой генетической основе, у нас есть данные о доступности, отражающие влияние каждого гена, связанного с хроматином. Это обеспечивает подробную карту между каждым геном и то, как его потеря влияет на организацию генома с разрешением одной клетки »

Д-р. Ноа Лискович-Брауэр, соавтор исследования и научный сотрудник лаборатории Санджаны, Нью-Йоркского центра генома и Нью-Йоркского университета

Всего команда исследовала более 100 генов, связанных с хроматином, и разработала «атлас хроматина», который показывает, как геном изменяется в ответ на потерю этих белков. Атлас показывает, что разные субъединицы в каждом из 17 целевых комплексов ремоделирования хроматина могут по-разному влиять на доступность генома.

Удивительно, но почти все эти комплексы имеют субъединицы, потеря которых вызывает повышенную доступность, и другие субъединицы с противоположным эффектом. В целом, наибольшее нарушение сайтов связывания факторов транскрипции, которые являются важными функциональными элементами в геноме, наблюдалось после потери АТ-богатого интерактивного домена, содержащего белок 1А ( ARID1A ), члена комплекса BAF. . По оценкам, мутации в комплексных белках BAF участвуют в 1 из каждых 5 видов рака.

В дополнение к методу CRISPR-sciATAC, команда также разработала набор вычислительных методов для картирования динамических движений нуклеосом, которые представляют собой белковые кластеры, вокруг которых обвивается ДНК. Когда нуклеосом больше, ДНК плотно скручена и менее доступна для связывания факторов транскрипции.

Это именно то, что команда обнаружила в специфических сайтах связывания факторов транскрипции, участвующих в пролиферации клеток после нокаута CRISPR ARID1A . При нацеливании на другой фермент, модифицирующий хроматин, эти же сайты подвергались увеличению расстояния между нуклеосомами, демонстрируя динамику позиционирования нуклеосом в определенных сайтах генома.

Метод CRISPR-sciATAC позволил группе систематически исследовать пластичность генома для нескольких ферментов, модифицирующих хроматин, и сайтов связывания факторов транскрипции.

«Мы действительно сосредоточились на том, чтобы сделать CRISPR-sciATAC доступным методом – мы хотели, чтобы это было чем-то, что могла бы сделать любая лаборатория. Мы производили большинство ключевых ферментов собственными силами и использовали простые методы выделения одиночных клеток, которые не требуют микрофлюидики или одноклеточных наборов », – сказал доктор Антонино Монтальбано, бывший научный сотрудник лаборатории Санджаны в Центре генома Нью-Йорка и Нью-Йоркского университета и соавтор исследования.

Для разработки технологии CRISPR-sciATAC исследователи использовали сочетание человеческих и мышиных клеток для создания процесса маркировки / идентификации, который позволил им расщеплять и штрих-кодировать ядра клеток, а также захватывать однонаправленные РНК, необходимые для Цели CRISPR.

Работа основана на предшествующей работе по комбинаторному индексированию отдельных клеток ATAC-seq (sciATAC-seq), проведенной доктором Джеем Шендуре из Вашингтонского университета и другими группами, разрабатывающими новые методы геномики одиночных клеток. CRISPR-sciATAC также использует уникальную, легко очищаемую транспозазу, которая была разработана в лаборатории инновационных технологий Нью-Йорка

.

Ключевым техническим препятствием была оптимизация экспериментальных условий для одновременного захвата направляющих РНК CRISPR и фрагментов генома для профилирования доступности при сохранении целостности ядерной оболочки каждой клетки.

«Интеграция профилей доступности хроматина в CRISPR-экраны для всего генома дает нам новый взгляд на регуляцию генов», – сказал д-р Санджана, член основного преподавателя NYGC, доцент кафедры биологии Нью-Йоркского университета и доцент кафедры нейробиологии. и физиологии, Медицинская школа им. Гроссмана Нью-Йоркского университета, старший автор исследования.

«С CRISPR-sciATAC у нас есть полное представление о том, как определенные модифицирующие хроматин ферменты и комплексы изменяют доступность и организуют взаимодействия, которые контролируют экспрессию генов. Хроматин создает основу для экспрессии генов, и здесь мы можем измерить влияние различные мутации хроматина. Мы надеемся, что этот атлас станет широко полезным ресурсом для сообщества и что CRISPR-sciATAC будет использоваться для создания подобных атласов в других биологических системах и контекстах болезней »

Source link