новая платформа обнаружения SARS-CoV-2 на основе CRISPR обнаруживает нуклеиновые кислоты с высокой чувствительностью и специфичностью

новая платформа обнаружения SARS-CoV-2 на основе CRISPR обнаруживает нуклеиновые кислоты с высокой чувствительностью и специфичностью

Коронавирусное заболевание 2019 года (COVID-19), вызванное новым коронавирусом, названным коронавирусом-2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), вызвало глобальную пандемию беспрецедентных масштабов, подавляющую системы общественного здравоохранения и экономики во всех странах. мир.

Обнаружение вирусной нуклеиновой кислоты было важной стратегией в ранней диагностике SARS-CoV-2. На данный момент было сообщено о четырех протоколах на основе CRISPR для обнаружения SARS-CoV-2. Образцы РНК с более чем 1 × 10 4 до 1 × 10 5 копий / мл (SHERLOCK) или 1 × 10 4 копий / мл (DETECTR) могут быть обнаруживается менее чем за час с помощью протоколов бокового потока.

<img alt=" CASdetec использовался для обнаружения SARS-CoV-2. a Кинетика флуоресценции sgRNA-3 для обнаружения RdRp. Клетки E. coli, несущие Blunt-SARS-CoV-RdRp или Blunt-SARS-CoV-2-RdRp, предварительно инкубировали при 95 ° C в течение 10 минут и использовали в качестве матриц для обнаружения RAA и CD. Последовательности PAM окрашены в зеленый цвет, протоспейсеры – в синий, несовпадения пар оснований – в красный. Планки погрешностей указывают стандартные ошибки среднего (s.e.m.), n = 3. RFU, относительные единицы флуоресценции. б Кинетика флуоресценции обнаружения RdRp с использованием 108 нМ sgRNA-3. Плазмида, несущая SARS-CoV-2-RdRp, была серийно разведена, как показано в легенде. п = 2. ΔRn, ΔФлуоресценция, которая относится к значению Rn экспериментальной реакции за вычетом значения Rn базового сигнала, генерируемого ABI 7500. c Кинетика флуоресценции обнаружения RdRp на основе F1 и R1. РНК SARS-CoV-2-RdRp серийно разводили, как показано в легенде. Планки погрешностей указывают (s.e.m.), n = 3. г Оценка перекрестной реактивности. Пламиды, содержащие целевой участок RdRp из шести эпидемических коронавирусов человека, были серийно разведены, как показано в легенде. п = 2. e Обнаружение псевдовируса SARS-CoV-2. Геном вируса экстрагировали с использованием набора для выделения вирусной РНК (спин-колонка). SARS-CoV разводили до 5 × 105 копий / мл. п = 2. f Обнаружение псевдовируса SARS-CoV-2. Вирус лечили прямым лизисом. SARS-CoV разводили до 5 × 105 копий / мл. n = 2. g Результаты CASdetec можно было наблюдать непосредственно под синим светодиодом. 3 реплики продуктов с рис. 1c были отображены при синем светодиодном освещении. h Схема, показывающая рабочий процесс CASdetec. Геном вируса экстрагировали набором или прямым лизисом. Последовательности-мишени предварительно амплифицировали изотермической амплификацией с последующим детектированием CD. Сигналы флуоресценции были получены либо от флюоресцентного ридера, либо при прямом наблюдении в синем свете. "Height =" 2436 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2021/5/s41421-020-0174- y _-_ susha_1.jpg "title =" CASdetec используется для обнаружения SARS-CoV-2. a Кинетика флуоресценции sgRNA-3 для обнаружения RdRp. Клетки E. coli, несущие Blunt-SARS-CoV-RdRp или Blunt-SARS-CoV-2-RdRp, предварительно инкубировали при 95 ° C в течение 10 минут и использовали в качестве матриц для обнаружения RAA и CD. Последовательности PAM окрашены в зеленый цвет, протоспейсеры – в синий, несовпадения пар оснований – в красный. Планки погрешностей указывают стандартные ошибки среднего (s.e.m.), n = 3. RFU, относительные единицы флуоресценции. б Кинетика флуоресценции обнаружения RdRp с использованием 108 нМ sgRNA-3. Плазмида, несущая SARS-CoV-2-RdRp, была серийно разведена, как показано в легенде. п = 2. ΔRn, ΔФлуоресценция, которая относится к значению Rn экспериментальной реакции за вычетом значения Rn базового сигнала, генерируемого ABI 7500. c Кинетика флуоресценции обнаружения RdRp на основе F1 и R1. РНК SARS-CoV-2-RdRp серийно разводили, как показано в легенде. Планки погрешностей указывают (s.e.m.), n = 3. г Оценка перекрестной реактивности. Пламиды, содержащие целевой участок RdRp из шести эпидемических коронавирусов человека, были серийно разведены, как показано в легенде. п = 2. e Обнаружение псевдовируса SARS-CoV-2. Геном вируса экстрагировали с помощью набора для выделения вирусной РНК (спин-колонка). SARS-CoV разводили до 5 × 105 копий / мл. п = 2. f Обнаружение псевдовируса SARS-CoV-2. Вирус лечили прямым лизисом. SARS-CoV разводили до 5 × 105 копий / мл. n = 2. g Результаты CASdetec можно было наблюдать непосредственно под синим светодиодом. 3 реплики продуктов с рис. 1c были отображены при синем светодиодном освещении. h Схема, показывающая рабочий процесс CASdetec. Геном вируса экстрагировали набором или прямым лизисом. Последовательности-мишени предварительно амплифицировали изотермической амплификацией с последующим детектированием CD. Сигналы флуоресценции были получены либо от флюоресцентного ридера, либо при прямом наблюдении в синем свете. "Width =" 1800 "/>

CASdetec, используемый для обнаружения SARS-CoV-2. a Кинетика флуоресценции sgRNA-3 для обнаружения RdRp. Клетки E. coli, несущие Blunt-SARS-CoV-RdRp или Blunt-SARS-CoV-2-RdRp, предварительно инкубировали при 95 ° C в течение 10 минут и использовали в качестве матриц для обнаружения RAA и CD. Последовательности PAM окрашены в зеленый цвет, протоспейсеры – в синий, несовпадения пар оснований – в красный. Планки погрешностей указывают стандартные ошибки среднего (s.e.m.), n = 3. RFU, относительные единицы флуоресценции. б Кинетика флуоресценции обнаружения RdRp с использованием 108 нМ sgRNA-3. Плазмида, несущая SARS-CoV-2-RdRp, была серийно разведена, как показано в легенде. п = 2. ΔRn, ΔФлуоресценция, которая относится к значению Rn экспериментальной реакции за вычетом значения Rn базового сигнала, генерируемого ABI 7500. c Кинетика флуоресценции обнаружения RdRp на основе F1 и R1. РНК SARS-CoV-2-RdRp серийно разводили, как показано в легенде. Планки погрешностей указывают (s.e.m.), n = 3. г Оценка перекрестной реактивности. Пламиды, содержащие целевой участок RdRp из шести эпидемических коронавирусов человека, были серийно разведены, как показано в легенде. п = 2. e Обнаружение псевдовируса SARS-CoV-2. Геном вируса экстрагировали с использованием набора для выделения вирусной РНК (спин-колонка). SARS-CoV разводили до 5 × 105 копий / мл. п = 2. f Обнаружение псевдовируса SARS-CoV-2. Вирус лечили прямым лизисом. SARS-CoV разводили до 5 × 105 копий / мл. n = 2. g Результаты CASdetec можно было наблюдать непосредственно под синим светодиодом. 3 реплики продуктов с рис. 1c были отображены при синем светодиодном освещении. h Схема, показывающая рабочий процесс CASdetec. Геном вируса экстрагировали набором или прямым лизисом. Последовательности-мишени предварительно амплифицировали изотермической амплификацией с последующим детектированием CD. Сигналы флуоресценции были получены либо от флюоресцентного ридера, либо при прямом наблюдении в синем свете.

Новая платформа обнаружения нуклеиновых кислот с помощью CRISPR – CASdetec

Чтобы добавить к существующим протоколам обнаружения нуклеиновых кислот на основе CRISPR, группа исследователей недавно разработала новый протокол обнаружения SARS-CoV-2, основанный на их ранее описанной платформе – CDetection (обнаружение ДНК, опосредованное Cas12b). Они объединили методы амплификации нуклеиновых кислот и протоколы обработки образцов с CDetection и создали интегрированную платформу обнаружения нуклеиновых кислот под названием CRISPR-assisted detection или CASdetec. CASdetec имеет предел обнаружения 1 × 10 4 копий / мл для псевдовируса SARS-CoV-2 без какой-либо наблюдаемой перекрестной реактивности.

Согласно имеющейся последовательности генома SARS-CoV-2, они сконструировали 7 sgRNA вокруг локуса RdRp в соответствии с рекомендацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Из-за большого сходства SARS-Cov-2 с SARS-CoV они провели первоначальные эксперименты с плазмидами обоих вирусов. Исследования кинетики флуоресценции показывают, что sgRNA-3 отличается тем, что может различать 2 коронавируса, а также дает наиболее отчетливый сигнал флуоресценции.

Выбранные sgRNA и праймеры могут использоваться для большинства известных геномов SARS-CoV-2

Поскольку CRISPR не может обнаруживать ДНК при <1–10 нМ продукта амплификации в реакционной смеси, увеличение молекулярных столкновений между мишенью и CRISPR имеет решающее значение для повышения чувствительности теста. Исследователи обнаружили, что увеличение концентрации sgRNA в 3 раза усиливает сигнал флуоресценции, а также отношение сигнала к фону. Кроме того, это также увеличивает скорость реакции. Они разработали и проверили праймеры RAA на соответствие их ранее оптимизированной sgRNA-3. Скрининг показал, что при использовании лучших пар праймеров с sgRNA-3, обнаружение нуклеиновой кислоты возможно в образцах РНК SARS-CoV-2 с 5 × 10 3 копиями / мл.

Исследователи также проанализировали все 1792 последовательности SARS-CoV-2 в GISAID до 26 марта 2020 года и обнаружили, что 1673 из этих последовательностей соответствуют выбранным ими праймерам и sgRNA. Только 3 из них имеют 1 несовпадение с прямым праймером, и только 2 из них имеют 1 несовпадение с обратным праймером, что позволяет предположить, что выбранные ими sgRNA и праймеры могут использоваться для большинства геномов SARS-CoV-2, о которых сообщается.

Чтобы подтвердить специфичность этого нового метода обнаружения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2, они протестировали протоколы против 6 коронавирусов – SARS-CoV, MERS-CoV, CoV-HKU1, CoV-229E, CoV- OC43 и CoV-NL63 – вызывающие респираторные заболевания. Результаты показывают отсутствие перекрестной реактивности с другими эндемичными коронавирусом и позволяют предположить, что их sgRNA и праймеры обладают высокой чувствительностью и специфичностью.

Процесс разработки и оптимизации анализа CASdetec может предложить руководство для будущего обнаружения нуклеиновых кислот на основе CRISPR

Подводя итог, авторы создали новую платформу для обнаружения нуклеиновых кислот на основе CRISPR – CASdetec. Платформа имеет множество процедур, включая амплификацию нуклеиновых кислот, обработку вирусов и обнаружение на основе CRISPR. CASdetec способна обнаруживать образцы псевдовирусов с> 1 × 10 4 копий / мл без какой-либо перекрестной реактивности с другими коронавирусами.

Кроме того, исследователи также оптимизировали рабочий процесс, чтобы провести обе реакции в одной пробирке, не открывая крышку. Это поможет предотвратить загрязнение аэрозолями и снизить количество ложноположительных результатов тестов.

По мнению авторов, для обеспечения точности CASdetec пользователи должны проявлять осторожность, чтобы избежать загрязнения аэрозолями нуклеиновых кислот. Они могут сделать следующее, чтобы избежать заражения: (а) выполнять обработку образцов, подготовку реагентов, амплификацию и анализ продуктов в разных помещениях; и (b) осторожно обращаться с образцами нуклеиновых кислот и реагентами, чтобы избежать заражения от прикосновения.

Исследователи недавно представили свой дизайн анализа и процесс оптимизации в переписке в журнале Nature . Они считают, что этот процесс может стать руководством для разработки и оптимизации будущих анализов обнаружения нуклеиновых кислот на основе CRISPR.

Группа заключает:

Мы создали платформу CASdetec, которая состоит из процедур, включая обработку вирусов, амплификацию нуклеиновых кислот и обнаружение на основе CRISPR ».

Source link