Новое исследование описывает структуру важного фермента, присутствующего в тяжелом остром респираторном синдроме коронавируса 2 (SARS-CoV-2), который является вирусом, ответственным за коронавирусную болезнь 2019 (COVID-19). Этот фермент, известный как 3'– 5 'экзорибонуклеаза коронавируса (ExoN), представляет собой проверяющий фермент, который удаляет неправильные нуклеозиды из рибонуклеиновой кислоты (РНК), которая является генетическим материалом SARS-CoV-2, обеспечивая тем самым точная репликация вирусного генома.

Введение нуклеозидов для ингибирования фермента РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) является одним из важных механизмов действия противовирусных препаратов, таких как ремдесивир; однако присутствие ExoN делает эти препараты бесполезными. Следовательно, недооценка структуры ExoN может помочь идентифицировать или помочь в разработке ингибирующих молекул, чтобы в конечном итоге ускорить процессы открытия лекарств.

Исследование: структурные основы Распознавание несоответствия ферментом коррекции SARS-CoV-2. Изображение предоставлено: creativeneko / Shutterstock.com

Справочная информация

На сегодняшний день не существует эффективных противовирусных препаратов против SARS-CoV-2. Однако его комплекс репликации / транскрипции (RTC) является многообещающей мишенью, наряду с его ядром из RdRp и других неструктурных белков (nsps). Аналоги нуклеотидов, такие как ремдесивир, вставляют неправильный нуклеотид в геном SARS-CoV-2, чтобы остановить репликацию; тем не менее, это событие может быть спасено корректурой ExoN.

Этот фермент, который обнаружен как N-концевой домен ExoN вирусного неструктурного белка 14 (nsp14), стимулируется nsp10, который также стабилизирует структуру его активного сайта. ExoN также разрушает двухцепочечную вирусную РНК (дцРНК), которая в противном случае активировала бы рецепторы распознавания патоген-хозяин (PRR). Это способствует иммунной способности ускользать от SARS-CoV-2.

Текущее исследование обсуждает молекулярное связывание субстратов с помощью ExoN, а также то, как этот фермент распознает и удаляет неправильно вставленные нуклеотиды или аналоги во вновь формирующейся цепи РНК.

Подробности исследования

Ученые использовали субстрат РНК шпильки, известный как TSP31, чтобы исследовать каталитическую активность ExoN. Это позволяло связываться с РНК, но не расщеплять РНК ферментом.

Используя сочетание методов эксклюзионной хроматографии (SEC), криоэлектронной микроскопии одиночных частиц (EM) и in silico исследователи обнаружили, что комплекс nsp10-nsp14-РНК также связывает на nsp8, хотя и в слабой и динамичной манере. Это связывание способствует стабильному связыванию с субстратом РНК, что позволяет расщеплять РНК с помощью ExoN. Он также увеличивает деградацию РНК комплексом nsp10-nsp14.

Как общий фактор для ферментных комплексов RdRp и ExoN, nsp8, по-видимому, играет решающую роль в переносе субстрата РНК между этими молекулами. Однако необходимо будет провести дополнительную работу, чтобы определить, как nsp8 исправляет несовпадающие нуклеотиды.

При изучении мутантной формы ExoN часть образца содержала тетрамеризованную форму комплекса nsp10-nsp14-РНК, который, по-видимому, предотвращает связывание nsp8.

( A ) Наложение комплекса SARS-CoV nsp10-nsp14 (васильковый синий, PDB 5C8U) и комплекса SARS-CoV-2 nsp10-nsp14-РНК ( оранжевый) иллюстрирует конформационные изменения петель α2-α3 и α4-α5 и сдвиг H268 на 2,6 Å в сторону РНК при связывании субстрата. ( B ) Структура активного сайта комплекса SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 (WT) -РНК. Ионы Ca ²⁺ зеленые сферы; каталитическая вода, красная сфера. Нуклеотидные остатки в Р-цепи РНК обозначены индексом «P.» + 1C _P –1C _P каталитическая вода и два иона металла активного центра накладываются друг на друга с их крио-ЭМ плотностями, очерченными на 10σ. ( C ) Структура активного сайта комплекса SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 (E191A) -РНК. Ионы Mg ²⁺ зеленые сферы. + 1C _P –1C _P и два иона металла в активном центре накладываются друг на друга с их крио-ЭМ плотностями, очерченными на 7σ.

Механизм связывания РНК-субстрата

Исследователи обнаружили, что связывание субстрата РНК с активным центром ExoN комплекса nsp10-nsp14-РНК SARS-CoV-2 дикого типа (WT) заставляет два иона металла связываться с каталитическим центром. Это запускает дальнейшие реакции, завершающие активный центр.

Подробное описание взаимодействий с дцРНК предполагает, что фермент сохраняет свою специфичность по отношению к субстрату. Кроме того, эти детали предоставляют информацию о структуре субстрата относительно других РНК вирусных и проверяющих ExoN, а также предсказываемого ExoN SARS-CoV.

Важно отметить, что все ExoN коронавируса имеют одни и те же контактирующие с РНК остатки в nsp14. Таким образом, у них одинаковый механизм распознавания субстрата.

( A ) Взаимодействие между SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN и остовом РНК T35P31. Нуклеотидные остатки в Т-цепной РНК обозначены индексом «Т», нуклеотидные остатки в Р-цепной РНК указаны индексом «Р». Водородные связи и солевые мостики показаны серыми пунктирными линиями. Взаимодействующие нуклеотидные и белковые остатки накладываются друг на друга с их крио-ЭМ плотностями, обозначенными контуром 7σ. ( B ) Взаимодействие между SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN и РНК T35P31 в положениях +1 и –1 азотистых оснований. Водородные связи и солевые мостики показаны серыми пунктирными линиями. π-π стэкинг-взаимодействия обозначены зелеными пунктирными линиями. Взаимодействующие нуклеотидные и белковые остатки накладываются друг на друга с их крио-ЭМ плотностями, обозначенными контуром 7σ. ( C ) Поверхностное представление кармана связывания субстрата SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN показывает ограниченное отверстие на стороне Т-цепи, которое предотвращает спаривание оснований в положении +1 субстрата РНК. Для ясности домен N7-MTase nsp14 не показан. ( D ) Поверхностное представление домена LASV NP ExoN. Субстрат дцРНК с полностью спаренными основаниями (показан на рисунках) связан в субстрат-связывающем кармане LASV ExoN. ( E ) Поверхностное представление комплекса ДНК E. coli Pol III ExoN. Узкий карман для связывания субстрата позволяет проникать только оцДНК.

Другие находки

Исследователи обнаружили, что свободный 3'-ОН субстрата РНК необходим для ExoN-опосредованного разрушения РНК. Это предполагает, что аналоги 3'-дезоксинуклеотидов могут потенциально действовать как эффективные терминаторы цепи RdRp, будучи устойчивыми к эксцизии ExoN.

Было также обнаружено, что SARS-CoV-2 ExoN принимает как одноцепочечные РНК (оцРНК), так и дцРНК субстраты, тем самым указывая на то, что коррекция несоответствия in vivo может действовать по крайней мере двумя различными способами.

Авторы также наблюдали, что РНК, содержащая ремдезивирмонофосфат (RMP), после включения ингибитора все еще могла связываться вирусным ExoN. Это согласуется с выводом о том, что эта RMP-терминированная РНК остается уязвимой для фермента, в то время как отсутствие ExonN увеличивает ее восприимчивость. Также следует изучить другие модификации.

Каковы последствия?

В этом исследовании обсуждается, как происходит коррекция несоответствия во время синтеза РНК SARS-CoV-2. Авторы также выясняют, какие части архитектуры фермента необходимы для распознавания РНК-субстрата и каталитического действия.

В совокупности авторы предлагают несколько предположений о возможных изменениях, которые могут быть сделаны в структуре рибозы для предотвращения ExoN-опосредованной устойчивости к ингибиторам нуклеотидных аналогов RdRp. Эта информация может быть особенно полезной при разработке мощных ингибиторов ExoN, которые можно комбинировать с такими препаратами, как ремдесивир, для более эффективного действия против SARS-CoV-2.

« Понимание этой структуры и молекулярных деталей того, как работает ExoN, может помочь направить дальнейшую разработку противовирусных препаратов .»