Пандемия еще далека от завершения, поскольку вариант Дельта наносит серьезный ущерб невакцинированному населению, а число случаев заболевания COVID-19 растет по всему миру. Несмотря на впечатляюще быстрое развитие диагностических тестов SARS-CoV-2 за последние полтора года, подавляющее большинство образцов пациентов по-прежнему необходимо отправлять в лабораторию для обработки, что замедляет темпы отслеживания случаев COVID-19. Если образец должен быть протестирован на конкретный вариант вируса, он должен быть генетически секвенирован, что требует еще больше времени и ресурсов.

Теперь исследователи из Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете, Массачусетского технологического института (MIT) и нескольких больниц в районе Бостона создали недорогой диагностический тест на основе CRISPR, который позволяет пользователям проверять себя на наличие SARS-CoV-2 и несколько вариантов вируса с использованием образца их слюны дома без дополнительных инструментов.

Диагностическое устройство, называемое SHERLOCK с минимальным набором инструментов (miSHERLOCK), простое в использовании и обеспечивает результаты, которые можно прочитать и проверить с помощью прилагаемого приложения для смартфона в течение одного часа. Он успешно различает три различных варианта SARS-CoV-2 в экспериментах и ​​может быть быстро перенастроен для обнаружения дополнительных вариантов, таких как Delta. Устройство можно собрать с использованием 3D-принтера и общедоступных компонентов примерно за 15 долларов, а повторное использование оборудования снижает стоимость отдельных анализов до 6 долларов каждый.

miSHERLOCK устраняет необходимость в транспортировке образцов пациентов в централизованное место тестирования и значительно упрощает этапы подготовки образцов, предоставляя пациентам и врачам более быструю и точную картину здоровья человека и сообщества, что имеет решающее значение во время развивающейся пандемии »[

.

Хелена де Пуч, доктор философии, соавтор, научный сотрудник, Институт Висс и Массачусетский технологический институт

Диагностическое устройство описано в статье, опубликованной сегодня в Science Advances .

От цепочки поставок до SHERLOCK

В качестве инструктора по педиатрии в Бостонской детской больнице со специализацией по инфекционным заболеваниям соавтор Роуз Ли, доктор медицины, уже более года работает на переднем крае пандемии COVID-19. Ее опыт в клинике послужил источником вдохновения для проекта, который в конечном итоге стал miSHERLOCK.

«Простые вещи, которые раньше были повсеместными в больнице, такие как мазки из носоглотки, внезапно стало трудно достать, поэтому рутинные процедуры обработки образцов были нарушены, что является большой проблемой в условиях пандемии», – сказал Ли, который также является Приглашенный научный сотрудник Института Висс. «Мотивом нашей команды для этого проекта было устранение этих узких мест и обеспечение точной диагностики COVID-19 с меньшей зависимостью от глобальных цепочек поставок, а также возможность точно определять варианты, которые начали появляться»

Для обнаружения SARS-CoV-2 в своей диагностике группа обратилась к технологии на основе CRISPR, созданной в лаборатории члена факультета Висса и старшего автора статьи Джима Коллинза, доктора философии. называется «специфическая высокочувствительная разблокировка ферментативного репортера» (SHERLOCK). SHERLOCK использует «молекулярные ножницы» CRISPR, чтобы вырезать ДНК или РНК в определенных местах, с дополнительным бонусом: этот конкретный тип ножниц также разрезает другие части ДНК в окружающей области, что позволяет создавать молекулы зондов нуклеиновых кислот для подавать сигнал, указывающий, что цель была успешно поражена.

Исследователи создали реакцию SHERLOCK, предназначенную для разрезания РНК SARS-CoV-2 в определенной области гена, называемого нуклеопротеином, который сохраняется во многих вариантах вируса. Когда молекулярные ножницы – фермент под названием Cas12a – успешно связывается и разрезает ген нуклеопротеина, одноцепочечные ДНК-зонды также разрезаются, производя флуоресцентный сигнал. Они также создали дополнительные тесты SHERLOCK, предназначенные для нацеливания на панель вирусных мутаций в последовательностях белка Spike, которые представляют три генетических варианта SARS-CoV-2: альфа, бета и гамма.

Вооружившись тестами, которые могут надежно обнаруживать вирусную РНК в пределах допустимого диапазона концентраций для диагностических тестов, разрешенных FDA, команда затем сосредоточила свои усилия на решении, возможно, самой сложной задачи в диагностике: приготовлении образцов.

Плюнь, погоди, сканируй

«Когда вы тестируете образец на нуклеиновые кислоты [like DNA or RNA]вам необходимо выполнить множество шагов, чтобы подготовить образец, чтобы вы могли действительно извлечь и амплифицировать эти нуклеиновые кислоты. он доставляется в испытательный центр, а также убедитесь, что он не заразен, если вы имеете дело с трансмиссивным заболеванием. Чтобы сделать этот диагностический тест действительно простым в использовании, для нас было важно максимально упростить его. насколько это возможно ", – сказал соавтор Сяо Тан, доктор медицинских наук, научный сотрудник Института Висс и инструктор по гастроэнтерологии в Массачусетской больнице общего профиля.

Команда решила использовать образцы слюны, а не мазки из носоглотки, в качестве метода сбора, потому что пользователям легче собирать слюну, и исследования показали, что SARS-CoV-2 обнаруживается в слюне в течение большего количества дней после заражения. . Но необработанная слюна сама по себе создает проблемы: она содержит ферменты, которые расщепляют различные молекулы, что приводит к высокому уровню ложноположительных результатов.

Исследователи разработали новую технику для решения этой проблемы. Во-первых, они добавили в слюну два химиката, называемые DTT и EGTA, и нагрели образец до 95 ° C в течение 3 минут, что устранило ложноположительный сигнал от необработанной слюны и вскрыло все вирусные частицы. Затем они включили пористую мембрану, которая была сконструирована так, чтобы удерживать РНК на своей поверхности, которую, наконец, можно было добавить непосредственно в реакцию SHERLOCK для получения результата.

Чтобы объединить подготовку образца слюны и реакцию SHERLOCK в одну диагностику, команда разработала простое устройство с батарейным питанием с двумя камерами: камерой для подготовки образцов с подогревом и камерой для реакции без подогрева. Пользователь плюется в камеру для пробоподготовки, включает нагрев и ждет от трех до шести минут, пока слюна не попадет в фильтр. Пользователь снимает фильтр и переносит его в колонну реакционной камеры, затем толкает поршень, который помещает фильтр в камеру, и прокалывает резервуар для воды, чтобы активировать реакцию SHERLOCK. Спустя 55 минут пользователь смотрит через тонированное окно трансиллюминатора в реакционную камеру и подтверждает наличие флуоресцентного сигнала. Они также могут использовать прилагаемое приложение для смартфона, которое анализирует пиксели, регистрируемые камерой смартфона, чтобы поставить четкий положительный или отрицательный диагноз.

Исследователи протестировали свое диагностическое устройство, используя клинические образцы слюны 27 пациентов с COVID-19 и 21 здорового пациента, и обнаружили, что miSHERLOCK правильно идентифицировал пациентов с COVID-19 в 96% случаев и пациентов без заболевания в 95% случаев. время. Они также проверили его эффективность против вариантов Alpha, Beta и Gamma SARS-CoV-2, добавив в здоровую человеческую слюну полноразмерную синтетическую вирусную РНК, содержащую мутации, представляющие каждый вариант, и обнаружили, что устройство было эффективным в отношении ряда вирусных РНК. концентрации.

«Одна из замечательных особенностей miSHERLOCK – это то, что он полностью модульный. Само устройство отделено от анализов, поэтому вы можете подключать различные анализы для конкретной последовательности РНК или ДНК, которую вы пытаетесь обнаружить», – сказал соавтор Девора Наджар, научный сотрудник в MIT Media Lab и Collins Lab. «Устройство стоит около 15 долларов, но при массовом производстве стоимость корпуса снизится примерно до 3 долларов. Анализы для новых целей могут быть созданы примерно за две недели, что позволит быстро разработать тесты на новые варианты COVID-19 и других заболеваний».

Готовы к работе в реальном мире

Команда miSHERLOCK создала свое устройство с учетом ограниченных ресурсов, поскольку пандемия выявила огромное неравенство в доступе к здравоохранению, существующее в разных частях мира. Аппаратное обеспечение устройства может создать любой, у кого есть доступ к 3D-принтеру, а файлы и схемы схем общедоступны в Интернете. Добавление приложения для смартфона также было направлено на настройки с ограниченными ресурсами, поскольку услуги мобильной связи доступны практически в любой точке мира, даже в районах, до которых трудно добраться пешком. Команда готова работать с производителями, которые заинтересованы в масштабном производстве miSHERLOCK для глобального распространения.

«Когда проект miSHERLOCK стартовал, мониторинг вариантов SARS-CoV-2 практически не проводился. Мы знали, что отслеживание вариантов будет невероятно важным при оценке долгосрочного воздействия COVID-19 на местные и глобальные сообщества. , поэтому мы заставили себя создать действительно децентрализованную, гибкую, удобную для пользователя диагностическую платформу », – сказал Коллинз, который также является профессором медицинской инженерии и науки Термер в Массачусетском технологическом институте. «Решив проблему подготовки образца, мы обеспечили, что это устройство практически готово к использованию потребителями как есть, и мы рады работать с промышленными партнерами, чтобы сделать его коммерчески доступным».

«Объединив передовые биотехнологии с недорогими материалами, эта команда создала мощное диагностическое устройство, которое может быть произведено и использовано на местном уровне людьми без ученой степени доктора медицины. Это прекрасный пример миссии Института Висс. в действии: предоставить изменяющие жизнь инновации в руки людей, которые в них нуждаются », – сказал директор-основатель Wyss Дон Ингбер, доктор медицины, доктор философии, который также является профессором сосудистой биологии Джуды Фолкмана в Гарвардская медицинская школа и Бостонская детская больница, а также профессор биоинженерии Гарвардской школы инженерии и прикладных наук Джона А. Полсона.

Source link