Новый ингибитор трансляции РНК SARS-CoV-2

Новый ингибитор трансляции РНК SARS-CoV-2

Поскольку поиск эффективных ингибиторов коронавируса 2 (SARS-CoV-2) тяжелого острого респираторного синдрома продолжается, в октябре 2020 года на сервере препринтов bioRxiv * было опубликовано недавнее исследование, проведенное учеными Медицинской школы Йельского университета. сообщает об ингибирующем эффекте препарата мерофлоксацин на сдвиг рамки во время репликации SARS-CoV-2. Это важное доказательство концепции, которая поддерживает потенциал нацеливания на -1 PRF в качестве эффективной противовирусной терапии при этой пандемии, а также против других бета-коронавирусов.

ORF1ab Translation and Frameshifting

SARS-CoV-2 связывается с клеткой-хозяином через свой спайковый белок и начинает реплицироваться, чтобы установить инфекцию. Трансляция вирусных белков начинается с фрагмента ORF1ab, который на сегодняшний день является самым большим, имеет длину более 21 т.п.н. и составляет 2/3 всего одноцепочечного генома.

Он кодирует полипротеин, который затем расщепляется на 16 неструктурных белков (nsp) под действием двух протеаз. Многие белки второй половины полипротеина играют жизненно важную роль в вирусной транскрипции и репликации. Сюда входят, среди прочего, nsp12, РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp), РНК-геликаза (Hel / nsp13) и проверяющая экзорибонуклеаза.

Трансляция ORF1b, 3'-стороны ORF1ab, требует сдвига рамки считывания для всех коронавирусов. Когда рибосомы достигают конца ORF1a, некоторым из них необходимо переместиться в ретроградном направлении на один нуклеотид. Это -1 запрограммированный сдвиг рамки рибосомы (-1 PRF).

После этого сдвига рамки считывания они продолжают транслировать остальную часть ORF в новую рамку считывания -1, пока не будет транслирован весь большой полипротеин. Если нет, они скоро достигнут стоп-кодона в кадре 0, что преждевременно завершит трансляцию. Это отключит репликацию вируса.

<img alt=" Экран с высокой пропускной способностью идентифицирует модуляторы PRF SARS-CoV-2 -1. "Height =" 1324 "src =" http://www.news-medical.net/image.axd? picture = 2020% 2f10% 2f% 402020.10.21.349225v1.jpg "title =" Экран с высокой пропускной способностью определяет модуляторы PRF SARS-CoV-2 -1. "width =" 1200 "/>

Экран с высокой пропускной способностью идентифицирует модуляторы PRF SARS-CoV-2 -1.

Структуры FSE

Часто обнаруживается, что область -1 PRF содержит 7-нуклеотидную скользкую последовательность (UUUAAAC в SARS-CoV-2) и нижележащую стабильную вторичную структуру, которая функционирует как элемент, стимулирующий сдвиг рамки считывания (FSE). Это вызывает короткие паузы в поступательном движении рибосомы, давая время тРНК для достижения правильного выравнивания относительно скользкой последовательности. Это частично требуется для -1 программируемого рибосомного сдвига кадра (PRF).

Одним из распространенных ФСЕ является псевдоузел РНК. Считается, что у SARS-CoV, SARS-CoV-2 и других бета-коронавирусов, возможно, трехстворчатый псевдоузел может действовать как FSE. Эта структура не очень распространена в мРНК хозяина. Поэтому его часто используют для проверки эффекта явного нарушения экспрессии вирусных генов, например, с помощью мутаций и лекарств, ингибирующих -1 PRF.

Это было продемонстрировано в репликации ВИЧ как экзогенным ингибитором -1 PRF, так и ключами, указывающими на то, что он является частью противовирусного ответа хозяина.

Мерофлоксацин ингибирует репликацию SARS-CoV-2

В текущем исследовании исследователи идентифицировали фторхинолоновый антибиотик мерофлоксацин путем высокопроизводительного скрининга на ингибиторы -1 PRF SARS-CoV-2. Они показывают, что инкубация с этим соединением подавляла репликацию SARS-CoV-2 в клетках Vero.

Хотя ивермектин также был ингибитором -1 PRF, он обладал цитотоксическим действием, в отличие от мерофлоксацина, который имеет лишь умеренные цитостатические эффекты даже при высоких уровнях. Это специфический ингибитор PRF бета-коронавируса -1, в отличие от других фторхинолонов, которые не обладают такой активностью. Это предполагает, что структурные группы в определенных конкретных сайтах могут быть ответственны за ингибирование сдвига рамки считывания.

Поскольку FSE последовательности SARS-CoV почти идентичен таковому SARS-CoV-2, мерофлоксацин подавляет сдвиг 1-рамки в обоих случаях почти одинаково. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC50) составляет ~ 20 мкМ, что превосходит 25% ингибирование, производимое другим ингибитором, называемым SHFL.

Мерафлоксацин является специфическим ингибитором ФСЭ бета-коронавируса, но не других коронавирусов или других распространенных вирусов. Другие сезонные коронавирусы имеют более сложную структуру псевдоузла, в отличие от 3-стебельного псевдоузла бета-коронавирусов.

Ингибирование мерофлоксацина препятствует побегу мутаций

Исследователи также обнаружили, что ингибирование сдвига рамки считывания, вызванное мерофлоксацином, сохраняется, несмотря на мутации в вирусном геноме. Известно, что РНК-вирусы обладают высокой скоростью мутаций, некоторые из которых могут сделать вирус устойчивым к противовирусному агенту. В исследование были включены уже известные мутации вируса.

Они обнаружили очень мало мутаций в последовательности FSE, что и следовало ожидать в свете большого значения -1 PRF для репликации вируса. Из 20 мутаций в этом регионе не менее 16 произошли только один раз. Из оставшихся четырех два находятся в стволе 1 и по одному в стволе 2 и 3.

Находясь на ножке, ничто из этого не могло привести к изменению трехствольной структуры псевдоузла. Однако исследователи обнаружили, что ингибирование -1 PRF мерофлоксацином происходило со всеми этими вариантами без потери эффективности.

Исходя из этих уже существующих мутаций, которые не изменили структуру псевдоузла, они затем исследовали влияние других мутаций, которые нарушили структуру. Они обнаружили, что это привело к сокращению сдвига кадров от 10% до 77%, в зависимости от их нарушения. Одно из наиболее значительных сокращений было вызвано мутацией одиночного непарного уридина, что указывает на его неизвестную функцию. Обе мутации, U13485, и следующая за ней G13486 полностью законсервированы среди коронавирусов человека.

Хотя эти мутации вызывают широкий спектр структурных пертурбаций, подавление сдвига рамки считывания, вызываемое мерофлоксацином, действующим на все эти варианты, остается почти таким же. Это указывает на то, что это действие сохраняется и мутации бегства маловероятны.

Ингибирование смены кадра препятствует репликации SARS-CoV-2

Затем исследователи изучили влияние ингибитора на репликацию вируса. Они обнаружили, что мерофлоксацин подавлял репликацию с самой низкой концентрации 1,25 мкМ, при которой полумаксимальная эффективная концентрация (EC50) составляла 2,6 мкМ. Когда концентрация лекарственного средства была повышена до 40 мкМ или выше, вирус становился необнаруживаемым. Падение выхода вируса было почти экспоненциально связано с ингибированием -1 PRF. Это указывает на то, что скорость репликации вируса зависит от эффективности сдвига рамки считывания.

Последствия и направления на будущее

FSE коронавирусов очень эффективны, и в этом исследовании изучается, насколько этот атрибут связан с жизнеспособностью вируса с помощью недавно идентифицированного ингибитора сдвига рамки считывания. Исследователи описывают результаты: « Почти экспоненциальная зависимость между вирусным титром и эффективностью -1 PRF указывает на простую модель, в которой трансляция ORF1b устанавливает предел скорости роста SARS-CoV-2 ».

Это оправдывает разработку ингибиторов -1 PRF для эффективного противодействия росту SARS-CoV-2 и другим РНК-вирусам того же типа PRF. Еще предстоит провести дополнительные исследования, чтобы выяснить механизм ингибирования -1 PRF мерофлоксацином.

Другие возможные объяснения

Результаты также можно объяснить абсолютной необходимостью в высокоэффективной PRF для достижения правильной стехиометрической корреляции между ферментами репликационного комплекса. Утрата этого баланса из-за снижения или увеличения эффективности -1 PRF даже незначительно влияет на рост вирусов.

Другая возможность заключается в том, что небольшое снижение каждого из ограничивающих скорость транслирования ферментов комплекса репликаза-транскриптаза накапливается, вызывая заметное снижение репликации вируса.

Это могло быть связано с прямым связыванием FSE, нарушением стабильности псевдоузла и, таким образом, уменьшением необходимой паузы рибосомы, необходимой для сдвига рамки. Другая точка зрения состоит в том, что это связывание придает дополнительную стабильность псевдоузлу, так что прибывающие рибосомы слишком долго застревают, сталкиваются или должны стоять в очереди, что нарушает процесс плавного удлинения трансляции.

Другие возможности включают стабилизацию неправильной конформации FSE, что исключает сдвиг рамки. Такие структуры недавно были продемонстрированы на клетках, инфицированных вирусом. Если будет обнаружено, что мерофлоксацин взаимодействует с одной или несколькими из таких непродуктивных структур, он может снизить эффективность ФСЕ за счет уменьшения доли продуктивных РНК.

Наконец, мерофлоксацин может действовать на модулирующие факторы хозяина, которые действуют на обратный сдвиг рамки считывания, такие как хеликазы РНК хозяина, которые могут участвовать в псевдоузле, не разворачивающемся после -1 PRF, но до продолжения трансляции. Известно, что фторхинолоны нацелены на бактериальные ДНК-топоизомеразы. Дальнейшие исследования позволят выявить аналогичные ферменты у высших организмов, включая аналоги РНК.

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.

Source link