На фоне растущих надежд на использование инструментов редактирования генов CRISPR для восстановления смертельных мутаций, связанных с такими состояниями, как муковисцидоз и серповидноклеточная анемия, новое исследование в журнале Nature Communications Biology описывает новое новшество, которое может ускорить это работать, быстро выявляя непреднамеренные и потенциально вредные изменения, вносимые процессом редактирования генов.

Мы разработали новый процесс для быстрого скрининга всех изменений, сделанных CRISPR, и он показывает, что может быть гораздо больше непреднамеренных изменений в ДНК вокруг места восстановления CRISPR, чем считалось ранее. "

Эрик Кмиц, доктор философии, директор Института редактирования генов ChristianaCare и главный автор исследования

В исследовании описывается новый инструмент, разработанный в Институте редактирования генов, который всего за 48 часов может идентифицировать «множественные результаты CRISPR-направленного редактирования генов», процесс, который обычно требует до двух месяцев дорогостоящего и сложного анализа ДНК.

Kmiec предупредил, что непреднамеренные изменения, выявленные их работой, включают «тонкие мутации» в ДНК вокруг непосредственного участка генома, предназначенного для восстановления. Это очень отличается, по его словам, от горячо обсуждаемой озабоченности по поводу риска того, что CRISPR вызовет мутации «вне цели», дрейфуя далеко от предполагаемого участка и делая случайные разрезы по всему геному.

«Важно отметить, что во всех случаях мы все еще видели, как CRISPR достигает фантастического уровня успешного ремонта, который был бы невообразим даже пять лет назад», – добавил ведущий автор Бретт Сансбери. «Но мы увидели много других изменений в ДНК рядом с местом восстановления, которые необходимо лучше понять, чтобы при исправлении одной проблемы мы не создавали другую».

Она сказала, что эти изменения включали в себя удаление, дублирование и перестановки кода ДНК. И хотя исследователи полагают, что подавляющее большинство этих непреднамеренных изменений может не иметь последствий для пациентов, важно идентифицировать их и определить, какие из них могут представлять риск. Например, Кмиц сказал, что непреднамеренные изменения в коде ДНК, который действует как программное обеспечение для определения того, как функционируют гены, могут дать указание гену производить вредный белок.

Согласно исследованию, «такая информация формирует основу для определения решений« риск-польза », касающихся эффективности инструментов генной инженерии для лечения заболеваний человека».

«CRISPR, вероятно, никогда не будет идеальным в 100% случаев», – сказал Кмиц. «Но инструменты CRISPR постоянно совершенствуются. И если мы сможем достичь точности на 70 или 80 процентов – и выявить и понять важность любых изменений, которые происходят вместе с этим ремонтом – это приближает нас к безопасному использованию CRISPR для лечения». пациенты. Мы надеемся, что наш новый инструмент поможет ускорить усилия по достижению этой цели ".

CRISPR расшифровывается как «сгруппированные регулярно пересекающиеся короткие палиндромные повторы». Это защитный механизм, обнаруженный у бактерий, который может распознавать и разрезать ДНК инвазивных вирусов.

Ученые узнали, как изменить этот механизм, чтобы он мог быть направлен на «редактирование» определенных последовательностей кода ДНК, с акцентом на восстановление мутаций ДНК, которые вызывают смертельные заболевания. Например, в настоящее время ведется работа по использованию CRISPR для восстановления генетической мутации, которая вызывает аномальные эритроциты у пациентов с серповидноклеточной анемией, и мутации, вызывающей разрушительное накопление слизи у пациентов с муковисцидозом.

Но Кмиц отметил, что большинство инструментов для анализа изменений гена CRISPR лучше всего подходят для проверки того, что восстановление прошло успешно, а не для выявления изменений, которые могут произойти с близлежащими цепями ДНК. Он сказал, что для того, чтобы пойти дальше, и проверка этих непреднамеренных правок потребовала извлечения и анализа огромного количества кода ДНК из клетки, своего рода процесс «иголки в стоге сена», который может занять до двух месяцев. И даже тогда он может не охватить все изменения. Исследование предупреждает, что в результате, когда исследователи сообщают об успешном использовании CRISPR для восстановления неисправных генов, они «могут непреднамеренно занижать побочную активность этой замечательной технологии».

Ученые из Института редактирования генов нашли способ обойти эту проблему, работая с разработанной ими системой, которая выполняет редактирование генов на кольцевых сегментах ДНК, выделенных из клетки, которые известны как плазмиды. Исследователи обнаружили, что работа в плазмидной или «бесклеточной» системе устраняет большую часть сложной биологической активности в клетке, что затрудняет выделение всего набора изменений ДНК, внесенных CRISPR.

В исследовании они сообщают, что их система позволила им «визуализировать широкий спектр генетических модификаций, созданных в процессе CRISPR-направленного редактирования генов прямым и простым способом». Кроме того, поскольку инструмент позволяет быстро и по доступной цене просматривать результаты редактирования, исследователи отмечают, что он освобождает ученых от необходимости выполнять и проверять несколько пробных изменений – гораздо больше, чем это практично для системы на основе ячеек. И это позволило бы им выявлять непреднамеренные мутации, которые могут возникать на относительно редких частотах и, таким образом, в противном случае остались бы незамеченными.

Это также позволяет им тестировать различные варианты CRISPR. Когда ученые используют инструменты CRISPR для редактирования гена, они могут использовать различные ферменты (например, Cas9 или Cas12a) для выполнения фактического разрезания и часто включают в себя нечто, называемое «шаблоном» ДНК, чтобы действовать в качестве карты для идентификации и восстановления поврежденного кода. Новое исследование показало, что уровень «точного восстановления» – ремонт, который осуществляется без внесения непреднамеренных мутаций – значительно варьировался в зависимости от используемого фермента и матрицы – от 5% до 64%.

Работа по разработке лучшего способа скрининга CRISPR-индуцированных мутаций является частью более широких усилий в Институте редактирования генов, который обеспечивает революционные достижения в редактировании плазмид ДНК, выделенных из клеток человека. Команда уже использовала свой «бесклеточный» подход для одновременного создания нескольких правок. Эта работа привела к сотрудничеству с биотехнологической фирмой для разработки новых подходов к персонализированному лечению рака. Инструмент, разработанный группой из Института редактирования генов, может быстро воспроизвести в образце ДНК человека уникальные и сложные генетические особенности раковой опухоли отдельного пациента. И эти образцы могут быть использованы для скрининга нескольких химиотерапевтических препаратов и других противораковых препаратов для разработки лечения, наиболее подходящего для отдельного пациента.