Подход с секвенированием может сосредоточить внимание на редкой мутации в большом количестве клеток, выявляя последствия для редактирования генома CRISPR и раннего обнаружения рака.

Современные методы секвенирования не обладают чувствительностью для обнаружения редких генных мутаций в пуле клеток, что особенно важно, например, для раннего выявления рака.

Теперь ученые из KAUST разработали подход, называемый целевым секвенированием отдельных молекул ДНК (IDMseq), который может точно обнаружить единственную мутацию в пуле из 10 000 клеток.

Важно отметить, что команда успешно использовала IDMseq для определения количества и частоты мутаций, вызванных инструментом редактирования генов CRISPR / Cas9 в эмбриональных стволовых клетках человека. В настоящее время проводятся клинические испытания для проверки безопасности CRISPR для лечения некоторых генетических заболеваний.

Наше исследование выявило потенциальные риски, связанные с редактированием CRISPR / Cas9, и предоставляет инструменты для лучшего изучения результатов редактирования генома ».

Мо Ли, ведущий автор исследования и биолог, Научно-технический университет имени короля Абдаллы

IDMseq – это метод секвенирования, который включает прикрепление уникального штрих-кода к каждой молекуле ДНК в образце клеток и последующее создание большого количества копий каждой молекулы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Скопированные молекулы имеют тот же штрих-код, что и исходные.

Набор инструментов биоинформатики, называемый анализом вариантов с уникальным молекулярным идентификатором для технологии длительного считывания (VAULT), затем декодирует штрих-коды и помещает аналогичные молекулы в свои собственные «ячейки», причем каждая ячейка представляет одну из исходных молекул ДНК. VAULT использует комбинацию алгоритмов для обнаружения мутаций в корзинах.

Этот процесс особенно хорошо работает с технологиями долгого считывания третьего поколения и помогает ученым обнаруживать и определять частоту всех типов мутаций, от изменений отдельных букв ДНК до крупных делеций и вставок в исходные молекулы ДНК.

Подход успешно обнаружил преднамеренно вызванную мутацию гена, которая была смешана с группой клеток дикого типа в соотношении 1: 100, 1: 1000 и 1: 10 000. Он также правильно сообщил о своей частоте.

Исследователи также использовали IDMseq для поиска мутаций, вызванных редактированием генома CRISPR / Cas9.

«В нескольких недавних исследованиях сообщалось, что Cas9 привносит неожиданные крупные делеции ДНК вокруг отредактированных генов, что вызывает опасения по поводу безопасности. Эти делеции трудно обнаружить и количественно оценить с помощью современных стратегий секвенирования ДНК. Но наш подход в сочетании с различными секвенированиями платформы, могут анализировать эти большие мутации ДНК с высокой точностью и чувствительностью », – говорит доктор философии. студент Чунвэй Би.

Тесты показали, что на большие удаления приходилось 2,8-5,4% результатов редактирования Cas9. Они также обнаружили трехкратное увеличение количества одноосновных вариантов ДНК в редактируемой области.

«Это показывает, что нам нужно многое узнать о CRISPR / Cas9, прежде чем его можно будет безопасно использовать в клинике», – говорит Яни Хуанг из Пекинского университета, который является международным сотрудником, софинансируемым KAUST.

IDMseq в настоящее время может секвенировать только одну цепь ДНК, но работа над двухцепочечным секвенированием может еще больше улучшить производительность, говорят исследователи.