Открытие низкомолекулярных ингибиторов может обеспечить точный контроль над редактированием генома CRISPR-Cas9

        

Открытие первых низкомолекулярных ингибиторов белка Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) могло бы обеспечить более точный контроль над редактированием генома на основе CRISPR-Cas9, сообщают исследователи 2 мая в журнале Cell Cell .

Разработав набор высокопроизводительных биохимических и клеточных анализов, исследователи просмотрели разнообразную коллекцию малых молекул, чтобы идентифицировать соединения, которые нарушают связывание SpCas9 с ДНК и тем самым препятствуют его способности разрезать ДНК. Эти первые низкомолекулярные ингибиторы CRISPR-Cas9 легко проникают в клетки и намного меньше, чем ранее открытые анти-CRISPR белки. Новые соединения позволяют осуществлять обратимое и дозозависимое управление технологиями на основе SpCas9, включая приложения для редактирования генов, редактирования баз и эпигенетического редактирования в клетках млекопитающих.

Эти исследования закладывают основу для быстрой идентификации и использования низкомолекулярных ингибиторов против нуклеаз, ассоциированных как с SpCas9, так и с CRISPR следующего поколения. Низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на связанные с CRISPR нуклеазы, могут широко использоваться в фундаментальных, биомедицинских и оборонных исследованиях, а также в биотехнологических применениях ».

Старший автор Амит Чоудхари из Института Брода, Гарвардской медицинской школы, Бригама и женской больницы

В настоящее время SpCas9 разрабатывается в качестве агента генной терапии для множества состояний, включая ВИЧ, нарушения зрения, мышечную дистрофию и другие наследственные нарушения. Но эти терапевтические применения значительно выиграют от точного контроля над дозой и временем активности SpCas9, чтобы уменьшить нежелательные эффекты. Контроль над этими аспектами активности SpCas9 может также принести пользу другим приложениям, таким как эффективное редактирование ДНК модельных организмов для моделирования и изучения болезней, а также использование генных приводов у генно-инженерных комаров, конструирующих комаров для сдерживания распространения малярии и других переносимых комарами заболевания.

Потребность в дозе и временном контроле SpCas9 создала потребность в молекулах анти-CRISPR. Хотя анти-CRISPR белки, которые нацелены на SpCas9, существуют, они являются большими и непроницаемыми для клеток, необратимыми в действии, могут быть пережеваны протеазами и могут представлять риск неблагоприятных иммунных реакций в организме. Напротив, низкомолекулярные ингибиторы являются протеолитически стабильными, обратимыми и, как правило, неиммуногенными и могут легко доставляться в клетки посредством пассивной диффузии. Кроме того, они могут быть синтезированы в больших масштабах при низкой стоимости с небольшой вариабельностью от партии к партии.

В новом исследовании Чоудхари и его команда представили надежную, чувствительную и масштабируемую платформу для быстрой и экономичной идентификации и проверки низкомолекулярных ингибиторов SpCas9. Измерение активности CRISPR-Cas9 с высокой пропускной способностью, которая позволила бы проводить скрининг лекарств, было сложной задачей из-за свойств фермента SpCas9. В новой статье Choudhary и коллеги разработали высокопроизводительный первичный и вторичный анализы на связывание SpCas9-ДНК и активность расщепления ДНК SpCas9 соответственно. Для первичного анализа они использовали биохимический метод, называемый флуоресцентной поляризацией, для мониторинга взаимодействия между SpCas9 и меченым флуорофором сегментом ДНК, содержащим последовательности PAM. Во вторичном анализе они использовали автоматизированную микроскопию для измерения флуоресцентных изменений, вызванных SpCas9-опосредованным расщеплением ДНК репортерного гена в клетках.

Используя эти анализы, исследователи сначала провели скрининг репрезентативных членов нескольких классов малых молекул, чтобы определить класс, члены которого часто ингибировали SpCas9. Исследователи определили два ведущих соединения, которые нарушают способность SpCas9 связывать ДНК и ингибировать опосредованное SpCas9 расщепление ДНК в зависимости от дозы в клеточных линиях человека. Так как они блокируют связывание ДНК ферментом, эти молекулы также ингибируют каталитически нарушенные технологии SpCas9, в том числе для активации транскрипции, и стабильны в плазме человека.

«Эти результаты закладывают основу для точного химического контроля за деятельностью CRISPR-Cas9, обеспечивая безопасное использование таких технологий», – говорит Чоудхари. «Однако эти молекулы не готовы для применения у людей и не проверены на эффективность в организмах».

В будущих исследованиях исследователи планируют идентифицировать сайты связывания ингибиторов в комплексе SpCas9: gRNA, исследовать механизм их действия и оптимизировать их активность. Они также будут определять, взаимодействуют ли молекулы с другими мишенями в клетках млекопитающих, и оценивать их специфичность по отношению к другим нуклеазам, связанным с CRISPR. Ранние результаты, включенные в статью Cell указывают на то, что молекулы весьма специфичны для своей мишени, поскольку они не влияют на отдаленно связанный фермент CRISPR, Cas12a.

Источник:

http://www.cellpress.com/

      

Source link