Пандемия коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19), вызванная тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), стала одной из самых серьезных проблем общественного здравоохранения во всем мире. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщает о более чем 254 миллионах случаев заражения SARS-CoV-2 и более 5,1 миллионах смертей с начала пандемии.
Исследование: LRRC15 подавляет инфекцию SATS-CoV-2 и контролирует выработку коллагена. Изображение предоставлено: Dotted Yeti / Shutterstock.com
Справочная информация
SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2 имеют сходные последовательности, причем их общий первичный рецептор входа представляет собой рецептор ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2). Несколько исследований, посвященных другим факторам хозяина, которые могут влиять на связывание SARS-CoV-2, ограничены.
Исследователи из Сиднейского университета недавно провели исследование, опубликованное на сервере препринтов bioRxiv * чтобы идентифицировать новые факторы хозяина, влияющие на клеточные взаимодействия шипового белка SARS-CoV-2, с использованием регулярных кластеров всего генома. активация разнесенных коротких палиндромных повторов (CRISPR). Рецептор клеточной поверхности, связанный с толл-подобным рецептором (TLR), известный как белок 15, содержащий богатые лейцином повторы (LRRC15), был идентифицирован в трех полных геномных скринингах как промотор спайкового связывания SARS-CoV-2.
Проточная цитометрия, иммунопреципитация и конфокальная микроскопия подтвердили, что LRRC15 образует комплекс клеточной поверхности с вирусом, но не поддерживает инфекцию. LRRC15 не является рецептором проникновения SARS-CoV-2; однако его эктопическая экспрессия подавляет псевдовирусную инфекцию SARS-CoV-2 и снижает инфицирование живых организмов SARS-CoV-2.
Высокопроизводительный скрининг для анализа спайкового связывания SARS-CoV-2 идентифицирует LRRC15
Более ранние исследования показали, что ACE-2 является основным рецептором для белка шипа SARS-CoV-2. Исследователи текущего исследования использовали скрининг активации CRISPR для выявления других факторов хозяина, влияющих на взаимодействие белков spike488.
Проточная цитометрия показала, что комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота (кДНК) ACE2 HEK293TACE2 имеет высокое сродство к spike488 по сравнению с клетками HEK293T дикого типа. Позднее три клона HEK293T-CRISPRa с одной направляющей рибонуклеиновой кислотой (sgRNA) также показали результаты, аналогичные сверхэкспрессии кДНК, и подтвердили, что CRISPRa-индуцированная экспрессия ACE2 способствует связыванию spike488.
Исследователи собрали геномную ДНК из неотобранных или отобранных spike488 клеток, и количество sgRNA было количественно определено путем секвенирования. Данные были впоследствии проанализированы с использованием аналитической платформы MAGeCK и нанесены на график с помощью MAGeCKFlute. Трансмембранный белок LRRC15 был самым популярным при пороговом значении FDR 0,25, за ним последовал входной рецептор SARS-CoV-2 ACE2.
LRRC15 подавляет спайк-опосредованное проникновение и инфицирование SARS-CoV-2
Чтобы подтвердить роль LRRC15 в связывании спайков SARS-CoV-2, исследователи трансфицировали кДНК LRRC15-GFP в клетки HEK293T и проанализировали связывание spike647 с помощью проточной цитометрии. Было обнаружено, что LRRC15 содержит две изоформы LRRC15_1 и LRRC15_2, обе из которых обнаруживают сильное спайковое связывание. Связывание spike647 не наблюдалось в клетках, трансфицированных зеленым флуоресцентным белком (GFP).
Исследование также показало, что экспрессия LRRC15 способствует спайковому связыванию в клетках HEK293T-ACE2-TMPRSS2 и что обе изоформы LRRC15 колокализованы с spike647.
Чтобы подтвердить взаимодействие между белком-спайком SARS-CoV-2 и LRRC15, спайк был добавлен к LRRC15-экспрессирующим клеткам с последующей иммунопреципитацией LRRC15. В случае как LRRC15_1, так и LRRC15_2, спайковый белок коиммунопреципитировался в элюате.
Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что экспрессия LRRC15 может способствовать связыванию спайков SARS-CoV-2 с клетками HEK293T, где LRRC15 усиливает спайковые взаимодействия в присутствии ACE2 и TMPRSS2. Исследователи также оценили роль LRRC15 как рецептора входа для SARS-CoV-2 и обнаружили, что он не служит рецептором входа; однако LRRC15 может подавлять спайк-опосредованное проникновение и инфицирование SARS-CoV-2.
(A) Люциферазный анализ для количественной оценки псевдовирусной инфекции SARS-CoV-2 в (B) WT HEK293T (n = 4) и (C) HEK293T- ACE2 – TMPRSS2 (n = 3). Клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей транскрипт 1 LRRC15, или пустым вектором в качестве контроля. Люминесценцию клеток LRRC15 нормализовали по контрольным клеткам. Значимость определялась с помощью двустороннего дисперсионного анализа, теста множественного сравнения Сидака; **** p <0,0001, *** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05.
(D) Анализ гибели клеток для количественной оценки инфицирования живым вирусом D614G SARS-CoV-2 в HEK293T- ACE2 – TMPRSS2 клетки. Гибель клеток определяли путем подсчета ядер через 48 часов после добавления вируса.
(E, F) Количественная оценка выживаемости клеток после инкубации с (E) D614G (n = 4) и (F) Delta (n = 3) живым вирусом SARS-CoV-2. Значимость определялась двухфакторным дисперсионным анализом, * p <0,05.
LRRC15 регулирует фиброз
В текущем исследовании использовался набор данных атласа клеток COVID-19 для подтверждения экспрессии LRRC15 в нескольких лимфатических сосудах, стромальных клетках децидуальной плаценты и фибробластах кожи, простаты и легких. Впоследствии экспрессия LRRC15 была подтверждена в фибробластах легких и нервных клетках у людей, не инфицированных SARS-CoV-2.
Аналогичные результаты наблюдались при секвенировании одноклеточной РНК других пациентов с COVID-19. Эти результаты подтверждают наблюдения исследователей in vitro которые показывают, что LRRC15 действует как врожденный иммунный барьер и не способствует заражению SARS-CoV-2.
Исследования легких пациентов с COVID-19 in vitro показали, что фибробласты, продуцирующие коллаген, экспрессируют LRRC15, который может регулировать фиброз легких. На основании всех этих результатов исследователи пришли к выводу, что связанный с TLR рецептор LRRC15 является регулятором инфекции, а также фиброза, таким образом контролируя исходы инфекции SARS-CoV-2 и «долгосрочного» COVID-19.
(A) Обзор типов клеток, экспрессирующих LRRC15 из существующих наборов данных секвенирования одноклеточной РНК.
(B) UMAP-график набора данных RNAseq с одним ядром легких (Мелмс и др.).
(C) характерный график и (D) точечная диаграмма показывает, что LRRC15 экспрессируется в фибробластах и нейронных клетках. Экспрессия LRRC15 в фибробластах также наблюдается в фибробластах отдельных исследований.
(E) Фибробласты обладают внутренней способностью связывания спайков, которая может быть дополнительно усилена сверхэкспрессией LRRC15. Фибробласты трансфицировали пустым векторным контролем или кДНК LRRC15 и способность связывания спайков количественно оценивали с помощью проточной цитометрии. MFI = Средняя интенсивность флуоресценции.
(F) Фибробласты не обладают врожденным тропизмом к SARS-CoV-2, а сверхэкспрессия LRRC15 не опосредует инфекцию. Нетрансфицированные GFP и LRRC15-GFP трансфицированные фибробласты были трансдуцированы 5 × 10 8 SARS-CoV- 2 частицы псевдовируса в течение 24 часов перед количественным определением с помощью люциферазного анализа. Эффективность трансдукции (люминесценция люциферазы) сравнивалась с пермиссивной клеточной линией HEK293T- ACE2 – TMPRSS2 .
]
(G) LRRC15, экспрессирующие фибробласты, снижали трансдукцию псевдовируса SARS-CoV-2 в HEK293T -ACE2 – TMPRSS2 . Люминесценция совместной культуры LRRC15 + была нормализована для контрольной совместной культуры GFP а ее значимость была определена с помощью метода Манн-Уитни. тест, * p <0,05.
«Дальнейшее исследование того, как LRRC15 способствует патологии SARS-CoV-2 349, поможет нам лучше понять и лечить эту и будущие пандемии».
* Важное примечание
bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие клинической практикой / поведением, связанным со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.