Даже несмотря на то, что пандемия коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19) продолжает наносить тяжелый урон жизни и здоровью населения мира, не говоря уже об экономической активности, эффективные методы лечения по-прежнему пользуются большим спросом. Несмотря на титанические усилия по разработке и перепрофилированию лекарств, оказалось мало результатов, оправдывающих вложения.

Новое исследование, проведенное учеными из Еврейского университета в Иерусалиме в Израиле, сообщает об открытии многообещающей группы ингибиторов E-канала со значительной противовирусной активностью. Из него можно было бы разработать новые препараты для лечения этого часто смертельного вируса.

Исследовательская группа опубликовала свои результаты в виде препринта на сервере bioRxiv *.

Вирусный белок E

Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), идентифицированный как патогенный агент этой пандемии, представляет собой оболочечный РНК-вирус с несколькими мембранными белками. Один из них – белок E.

Белок E принимает участие в жизненном цикле вируса, участвуя в его сборке, высвобождении и механизме заболевания у других коронавирусов. По-видимому, они играют ключевую роль в вирусной инфекционности. Когда белок Е экспрессируется слабо, вирион также ослабляется и может служить в качестве вакцинного агента.

E-белки SARS-CoV и SARS-CoV-2, среди других подобных белков, являются ионными каналами для транспортировки катионов в клетку.

Это классические мишени для разработки лекарств, такие как блокаторы кальциевых каналов при гипертонии, натриевые каналы при муковисцидозе и многие другие. В случае вируса гриппа аминоадамантиновые препараты подавляют активность вирусного М-белка, который является ионным каналом. Однако они больше не очень полезны из-за широкого развития сопротивления.

Скрининг с помощью реципрокных тестов

В текущем исследовании использовались уже одобренные в библиотеках препараты для проверки около 3000 препаратов, ингибирующих E-каналы. Исследователи изучили хиты на предмет возможной активности против SARS-CoV-2.

В качестве первого шага белок E экспрессировался в бактериях в избытке, вызывая повышенную проницаемость мембраны и, таким образом, подавляя рост. Таким образом, ингибиторы вирусного канала легко идентифицируются по восстановлению роста бактерий.

Затем они проверили химическую библиотеку при концентрациях 50 мк M в поисках совпадений. Затем каждое попадание в этом отрицательном анализе подвергалось скринингу при различных концентрациях.

Чтобы исключить мешающие факторы, которые также могут повлиять на рост бактерий, они протестировали каждое из включенных в короткий список соединений с помощью теста взаимного ингибирования.

Во втором анализе использовались бактерии, которые не могут поглощать ионы калия в нормальной клеточной среде, но процветают после экспрессии калиевого канала даже в среде с низким содержанием калия. Этот положительный анализ дает результаты блокады каналов в форме ограниченного роста.

Здесь снова удары были дополнительно проверены методом доза-ответ.

Наконец, для обнаружения изменений pH бактерий использовали тест на основе флуоресценции. Если бактерии подвергаются воздействию подкисленной среды и если они выражают канал для ионов водорода, результатом является очевидная флуоресценция. Следовательно, блокада водородных ионных каналов вызовет снижение флуоресценции.

Из восьми совпадений в двух анализах шесть были активны против канала, что отражалось снижением флуоресценции. Исключением были 5-азацитидин и меброфенин.

Цитотоксичность измеряли для каждого соединения в отношении маркеров клеточной метаболической активности.

Из большого количества протестированных соединений они нашли восемь совпадений, к которым были добавлены еще два из более раннего исследования блокаторов кальциевых каналов. Они были протестированы против вирусов в культуре.

При концентрации 10 мк M девять из десяти соединений ингибировали рост вируса, снижая вирусную нагрузку на 98% в одном случае (5-азацитидин). Шесть снизили ее на 40-50%, а двое других снизили ее до четверти. Мемантин был исключением, вероятно, из-за его низкого сродства.

Никакой токсичности в отношении клеток-хозяев не наблюдалось, за исключением 5-азацитидина. Прямая цитотоксичность этого препарата, возможно, в значительной степени способствовала его очень высокой противовирусной активности, а не селективному ингибированию Е-канала.

Каковы последствия?

Перепрофилирование – это не только надежный и ценный путь к открытию лекарств против конкретных целей, особенно против вирусов. Он также использует одобренные лекарства, сокращая время и химическое пространство, необходимое для получения эффективного агента.

Большинство исследований перепрофилирования основывались на in silico методах, в то время как некоторые использовали экспериментальный план. Подход, использованный в этом исследовании, отличался тем, что большая библиотека была проверена на соединения с ингибирующей активностью против белка E.

Эти каналы не только хорошо подходят в качестве мишеней для лекарств, но и их ингибиторы можно быстро и дешево найти без дорогостоящих экспериментальных рабочих процессов. Использование бактерий для скрининга могло бы позволить идентифицировать гораздо больше ингибиторов единственной белковой мишени из-за присущего этим микробам генетического отбора, обеспечивающего более высокую толерантность к токсичности.

Использование двух взаимных анализов сводит к минимуму вероятность обнаружения неправильных попаданий.

Высокие скрининговые концентрации, использованные в этом исследовании, позволили идентифицировать восемь соединений – высокий выход. Даже при относительно низком сродстве такие препараты могут также обладать значительной противовирусной активностью при дальнейшей модификации. В качестве альтернативы они могут обладать синергетической противовирусной активностью в сочетании с другими селективными ингибиторами, направленными против других вирусных мишеней.

Ингибирование E-канала может быть не единственным механизмом противовирусной активности, действующим среди этих соединений. Действительно, с помощью 5-азацитидина транскрипционные сети могут быть широко изменены благодаря его известной функции как донора метила ДНК.

Таким образом, результаты представляют собой хит-лист одобренных препаратов, которые могут быть использованы в качестве отправной точки для синтеза ингибиторов SARS-CoV-2. Этот подход может быть использован для идентификации других полезных ингибиторов ионных каналов, чтобы помочь бороться с этим и другими вирусами.

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие в клинической практике / поведении, связанном со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.