Каковы преимущества замены буфера и каковы преимущества выполнения этой работы?

Обмен буфера – это процесс переноса большой биомолекулы из одного раствора в другой. Это может быть утомительно и часто является источником ошибок обработки, но это задача, которую необходимо выполнить, чтобы сохранить стабильность биомолекулы или подготовить ее к следующему этапу обработки.

Это очень очевидно в случае липидных наночастиц (LNP). LNP образуются там, где буфер не может оставаться на месте долгое время из-за присутствия органического растворителя, что подчеркивает необходимость быстрой замены буфера.

Другие примеры включают вирусные векторы и AAV, продуцируемые в очень разбавленных концентрациях, часто на порядки ниже уровней, требуемых для дозирования, которые необходимо заменить и сконцентрировать для дальнейшей работы по характеристике.

Нуклеиновые кислоты, белки и антитела часто требуют замены буфера между стадиями обработки и очистки. Раствор может страдать от разбавления из-за хроматографии, присутствия слишком большого количества соли, неправильного pH или использования неправильного буфера, и точка. Эти образцы следует заменить в буфер, чтобы обеспечить стабильность для последующего конъюгации, хранения или определения характеристик. Это особенно важно при работе с антителами из-за большого объема работы, связанной с формулированием, оптимизацией и скринингом. Использование липидных наночастиц и AAV сравнительно недавно, и разработка рецептур менее изучена, но, тем не менее, важно превратить их в стабильный раствор и в нужной концентрации.

Какие обычно используются методы замены буфера?

Обмен буфера – это повсеместный процесс, и есть много способов сделать это. Большинство из этих методов являются низкотехнологичными. Например, диализ, который можно оставить без присмотра в течение длительного периода времени, обычно на ночь.

Компромисс за то, чтобы быть полностью удаленным, заключается в том, что образец часто разбавляется в процессе, что требует использования дополнительной, отдельной стадии концентрирования.

Фильтры центрифугирования создают противоположную проблему – они быстрые и могут быть доведены до требуемых объемов, но пользователи должны следить за ними на протяжении всего процесса и контролировать их. Сложно запустить несколько выборок или легко их отследить, потому что есть вероятность, что один или два из них будут работать медленнее, чем остальные, или будут отличаться от них.

Фильтрация тангенциального потока (TFF) остается наиболее высокотехнологичным из широко используемых методов, но невозможно подойти и использовать этот подход. Насосы надо ставить рядом с дорогой кассетой, а пробег занимает много времени. Обычно за один раз можно анализировать только одну пробу, и этот метод лучше всего подходит для крупномасштабных процессов объемом 50 мл или более.

К счастью, Big Tuna предлагает несколько способов избавиться от части этой работы по замене буфера и подготовке проб – особенно для AAV и LNP.

Когда мы разрабатывали Big Tuna, мы искали решение, которое позволило бы пользователям выполнять обмен буферами надежным, оптимизированным и автономным способом.

Не могли бы вы дать нашим читателям обзор Big Tuna и то, как это помогает улучшить процесс замены буфера?

Big Tuna – это полностью автоматизированная платформа для замены буфера и концентрирования, которая может обрабатывать образцы во многих различных форматах. Его можно использовать с всего лишь 100 мкл образца в 96-луночном формате или почти 50 мл в 24-луночном формате. Он также может использоваться с широким спектром молекул и может похвастаться рядом полезных функций и возможностей.

Big Tuna – это обменная станция на базе фильтровальных пластин. В нем используется расходный материал Unfilter, разработанный собственными силами Unchained Labs. 96-луночный формат – это формат SBS с рабочим диапазоном от 100 мкл до 450 мкл на лунку, тогда как 24-луночный формат имеет рабочий диапазон от 450 мкл до 8 мл на лунку.

В обоих форматах используются мембраны из регенерированной целлюлозы с различными порогами молекулярной массы – 10, 30 и 100 килодальтон. С точки зрения стоимости, это сопоставимо с фильтром центрифугирования, но формат чашки Big Tuna более удобен для одновременной обработки большого количества образцов.

Каковы ключевые принципы работы Big Tuna?

Big Tuna использует модифицированный процесс ультрафильтрации диафильтрации. Пользователи загружают образцы в нефильтр, который помещается в камеру для замены буфера. Big Tuna измеряет объем с помощью бесконтактного акустического датчика и запускает цикл плавного повышения давления с орбитальным перемешиванием.

После периода повышения давления Big Tuna останавливается, снова измеряет объем и определяет, сколько буфера было удалено из образца. Он заполняет каждую лунку новым буфером или самим образцом и снова запускает процесс. Каждая лунка отслеживается индивидуально, потому что, как уже упоминалось, иногда образцы будут работать по-разному по разным причинам, и важно гарантировать, что более быстрые пробы не высыхают, пока пользователи ждут завершения медленных проб.

Этот цикл повторяется до тех пор, пока либо к пробе не будет добавлен желаемый объем, либо пока он не будет заменен в новый буфер до желаемой степени.

Этот процесс фильтрации является адаптивным, что означает, что он будет повышать давление в течение консервативного периода времени вначале, определять скорость потока для проб внутри, а затем устанавливать время повышения давления в будущем на основе скорости потока пробы. Затем он регулирует время нагнетания в зависимости от максимальной скорости потока. Это гарантирует максимально эффективное завершение процесса без чрезмерного концентрирования образцов.

Big Tuna также имеет программируемый уровень давления, который обеспечивает надлежащее обращение с образцом. Большинство образцов обмениваются и концентрируются при 60 фунтах на квадратный дюйм или около 4 бар, но мы обнаружили, что некоторые типы образцов, такие как AAV и низкие концентрации нуклеиновых кислот или белков, текут намного быстрее, и их можно обменять и сконцентрировать при давлении всего 15 фунтов на квадратный дюйм или около 1 бар.

Использование орбитального перемешивания как части процесса обеспечивает эффективный обмен. Это можно понять, противопоставив орбитальное перемешивание тупиковой фильтрации. Тупиковая ультрафильтрация концентрирует белок на поверхности мембраны по мере того, как происходит обмен. Это замедляет поток и создает градиент концентрации в образце, который может привести к ряду нежелательных эффектов, таких как засорение и загрязнение мембраны или агрегация из-за более высокой концентрации образца, чем обычно.

Чтобы избежать этих проблем, Big Tuna использует процесс орбитального перемешивания, чтобы обеспечить постоянство и однородность потока во время процесса обмена. Это не только ускоряет обмен, но и обеспечивает наилучшее обращение с образцом.

Автоматизация этого процесса предлагает большую степень управления процессом, чем это было бы возможно с помощью ручных методов. Оператор может предварительно установить процент удаления за цикл: объем буфера, удаляемый в каждом цикле повышения давления. Разбавленные или очень прочные образцы могут работать с более высоким процентом удаления, что сокращает количество необходимых циклов для полной замены.

Для высоких концентраций, незнакомых образцов или когда есть опасения, что замена буфера будет слишком резкой, можно использовать более низкий процент удаления, чтобы гарантировать постепенное введение образца в новый буфер, не подвергая образец дополнительному напряжению. Обычно циклов больше, но они короче.

Процент обмена представляет собой общий объем замененного буфера. Большинство процессов обмена буфером нацелены на полный обмен – от 96% до> 99%. В случаях, когда пользователи хотят установить свойство потока или охарактеризовать уже известные типы образцов, может быть достаточно более низкого процента обмена.

Big Tuna позволяет концентрироваться напрямую, без замены буфера. Это достигается за счет использования всего диапазона громкости пластины. Для 24-луночных планшетов это может быть от 8 мл до 450 мкл.

В системе также есть приложение, которое позволяет пользователям продолжать добавлять до 40 мл дополнительного образца обратно в этот 24-луночный планшет на протяжении всего процесса, обеспечивая более 100-кратное концентрирование с 48 мл до 450 мкл.

Чем полезны пресеты, доступные в Big Tuna?

Невозможно использовать один и тот же процесс для каждого образца. Биомолекулы имеют очень разные размеры и очень разные свойства текучести в растворе.

Чтобы упростить процесс разработки и учесть эти различия, Big Tuna имеет предварительные настройки, основанные на типе молекулы и концентрации. Это позволяет пользователям, которые никогда не использовали Big Tuna, ориентироваться в процессе и определять оптимальный подход к анализу пробы. Мы сделали основу и уже запрограммировали наилучший подход для работы с общими типами образцов.

Несмотря на то, что время цикла давления является адаптивным, знание того, что он должен начинаться при более низком давлении или при другом проценте удаления для конкретного типа образца, является полезной отправной точкой для тех, кто никогда раньше не использовал этот прибор.

Big Tuna удобен и эффективен, и пользователи, как правило, быстро становятся экспертами. На этом этапе пользователи могут переопределить эти предустановки и запустить их таким образом, который наиболее подходит для их конкретных сэмплов.

Не могли бы вы предоставить нашим читателям несколько примеров и тематических исследований, чтобы проиллюстрировать особенности большого тунца особенно в отношении генной терапии и приготовления вакцин?

Липидные наночастицы являются хорошим примером концепции векторов для генной терапии. LNP образуются комбинацией двух различных фаз – водной фазы, которая содержит генетическую полезную нагрузку и поверхностно-активное вещество, и органической фазы, которая содержит органический растворитель и другие полимеры, составляющие LNP.

Эти две фазы объединяются для создания эмульсии, внутри которой образуются наночастицы, инкапсулирующие генетическую полезную нагрузку.

Важно немедленно удалить весь этанол (обычно из органической фазы) и стабилизировать молекулу с присоединенной полезной нагрузкой. Как только эмульсия образуется, ее необходимо заменить, чтобы удалить этанол.

Для этой экспериментальной работы мы взяли люциферазу Firefly, мРНК инкапсулировали LNP в 10% этаноле, заменили буфер непосредственно на PBS и сконцентрировали его втрое.

Это было достигнуто с использованием нефильтра 24 100 кДа. Его больший объем и более высокая граничная молекулярная масса обеспечивали максимально быстрый поток. Предварительная установка LNP на приборе упростила этот обмен, который был при давлении 60 фунтов на квадратный дюйм и занимал около 90 минут, включая этап концентрирования.

Эта работа преследовала двоякую цель. Первая цель заключалась в том, чтобы подтвердить, что можно достичь целевого значения концентрации, а именно концентрации пробы примерно в три раза.

Это было успешно достигнуто. Big Tuna может измерять объем на протяжении всего процесса, и в конце мы установили, что уменьшили объем в три раза.

Перед тем, как начать, мы также определили, что процент инкапсуляции составляет 98%. Когда мы закончили, мы были в пределах пары процентов от этой цели, что означает, что мы не повредили LNP в процессе замены этанола.

Все это было достигнуто за один этап, без необходимости покидать образец камеры или без остановки процесса и выполнения каких-либо дополнительных действий.

AAV, как и многие образцы, производятся в низких концентрациях в большом объеме. Нашей целью было разработать способ простого концентрирования образцов с минимальным вмешательством пользователя, поэтому мы разработали новое приложение, чтобы сделать это возможным на Big Tuna.

Unfilter 24 обычно может концентрировать от 8 мл до 450 мкл, но некоторые приложения начинаются с более чем 8 мл. Поэтому мы разработали метод, при котором пользователи добавляют 8 мл в Unfilter 24, а затем помещают оставшуюся часть образца в резервуары, которые находятся на палубе.

Этот подход позволяет пользователям добавлять дополнительно 40 мл каждого образца для 24 образцов одновременно.

Нефильтр 24 подготавливается и помещается в сменную камеру точно так же, как и замена буфера. В отличие от замены буфера, после этапа повышения давления и измерения объема Big Tuna добавляет образец вместо буфера. Прибор будет повторять этот цикл до тех пор, пока объем, запрошенный оператором, не будет перенесен и в каждую лунку нефильтра 24 попадет 8 мл образца.

Если пользователи хотят сконцентрироваться дальше, они могут сделать это в том же Unfilter, взяв 8-миллилитровый планшет и сконцентрировав его до 450 мкл. В сочетании эти два этапа восстановления приводят к уменьшению объема одной пластины более чем в 100 раз.

Мы взяли AAV9 в объеме 18 мл и, используя описанные выше шаги, добавили 8 мл образца AAV в нефильтр 24 30 кДа и добавили 10 мл в резервуар на палубе.

После того, как 18 мл были уменьшены до 8 мл, была проведена стадия концентрирования для уменьшения с 8 мл до 500 мкл.

Оба процесса используют предварительную настройку Big Tuna AAV, которая работает при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм. Первоначально концентрация была около 5E11, и мы смогли достичь концентрации в пределах 5% от целевого значения. Что касается самого объема, мы увеличили объем с 18 мл до 500 мкл, достигнув 5% от целевого значения.

Чтобы подтвердить, что соотношение пустого / полного капсида AAV было одинаковым до и после замены буфера, мы протестировали его с помощью приложения на платформе Stunner под названием AAV Quant. Мы начали с заполнением примерно двух третей капсида, а закончили примерно на 75%.

Весь процесс, включая 36-кратное концентрирование, занял около 90 минут и поддерживал полезную нагрузку капсида в образце на всем протяжении.

Может ли большой тунец также использоваться в процессе обессоливания нуклеиновых кислот?

Да. Обессоливание нуклеиновых кислот возможно на многих платформах, но преимущество выполнения этого на Big Tuna заключается в использовании прибора орбитального перемешивания и его однородности образца по всей пластине.

Другие методы – например, вакуумная фильтрация – часто демонстрируют краевые эффекты или узор улыбки, что влияет на способность достичь правильной концентрации. Для Big Tuna это не проблема.

Мы провели эксперимент, подтверждающий концепцию, в котором мы взяли двухцепочечную ДНК в буфере TE и сконцентрировали ее втрое, используя обе доступные 30-килодальтонные планшеты – Unfilter 96 и Unfilter 24.

В данном случае мы стремились снизить концентрацию с 2 мг / мл до примерно 6 мг / мл. Данные Unfilter 96 показали, что это было немного выше целевого, но объем был достигнут, и потери материала не было.

Данные Unfilter 24 подтвердили, что у нас было правильное количество ДНК, присутствующее в конце процесса, и что цели обмена были достигнуты.

О Unchained Labs

Unchained Labs призвана помочь исследователям в области биологии и генной терапии освободиться от инструментов, которые никуда не годятся. Выпуск продуктов для решения проблем, которые имеют огромное значение для реальной науки, которой они занимаются каждый день. Это их мантра, их обещание, и они признают это.