С помощью микроскопии высокого разрешения теоретически возможно получить изображение клеточных структур с разрешением в несколько нанометров. Однако на практике это пока невозможно.
Причина этого заключается в том, что антитела, несущие флуоресцентный краситель, обычно используются для маркировки клеточных структур. Следовательно, краситель расположен не непосредственно в структуре мишени, а на расстоянии около 17,5 нанометров от нее. Частично из-за этой ошибки расстояния теоретически достижимое разрешение не может быть достигнуто до сих пор.
Публикация в Nature Communications
Международная исследовательская группа уже преодолела это препятствие. Это было достигнуто путем сочетания методов микроскопии сверхразрешения dSTORM и расширения микроскопии (ExM). Журнал Nature Communications представляет результаты.
Публикацией руководила группа из Биоцентра Юлиуса-Максимилиана-Университета (JMU) Вюрцбург в Баварии, Германия: профессор Маркус Зауэр, заведующий кафедрой биотехнологии и биофизики, со студентами PhD Фабианом Цветтлером и Себастьяном Рейнхардом. Профессора Пол Гишар из Женевского университета (Швейцария) и Тоби Белл из университета Монаш (Австралия) также сыграли ключевую роль.
Препятствия для объединения dSTORM и ExM
Метод dSTORM, разработанный в группе профессора Зауэра, достигает почти молекулярного разрешения около 20 нанометров. Для дальнейшего увеличения разрешения комбинация с расширенной микроскопией, которая была доступна в течение нескольких лет, казалась многообещающей.
В ExM исследуемый образец сшивается в набухающий полимер. Затем взаимодействия молекул в образце разрушаются, и образцу дают набухать в воде. Это приводит к расширению: молекулы, которые должны быть изображены, смещаются в пространстве в четыре раза.
Почему два метода не могли быть объединены до сих пор:
- Флуоресцентные красители, используемые для dSTORM для маркировки молекул, не пережили полимеризацию водного геля.
- Для dSTORM необходим буферный раствор, но расширенный образец в таких буферах сжимается до своего первоначального размера.
Ошибка расстояния значительно уменьшена
«Стабилизируя гель и иммунное окрашивание только после расширения, мы могли бы преодолеть эти препятствия и успешно объединить два метода микроскопии», говорит Маркус Сауэр. В результате ошибка расстояния растягивается до пяти нанометров при увеличении в 3,2 раза. Это впервые делает возможным получение флуоресцентного изображения с молекулярным разрешением.
Исследователи использовали центриоли и структуры, состоящие из белка тубулина, чтобы показать, насколько хорошо работает их метод. Они смогли визуализировать тубулиновые трубки в виде полых цилиндров диаметром 25 нанометров. Исследователям удалось получить четкие изображения групп из трех, состоящих из тубулиновых структур, на расстоянии от 15 до 20 нанометров в центриолях. Центриоли – это клеточные структуры, которые играют важную роль в делении клеток.
Заключение профессора Зауэра: «Для многих важных клеточных компонентов комбинация ExM и dSTORM позволяет нам впервые получить детальное представление о молекулярной функции и архитектуре. Поэтому команда планирует применить метод к различным структурам, органеллам. и многопротеиновые комплексы клетки.
Источник: https://www.uni-wuerzburg.de/en/universitaet/