Тяжелый острый респираторный синдром, вызванный коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), инициируется взаимодействием между рецептором человеческого ангиотензинпревращающего фермента типа 2 (ACE2) и белком SARS-CoV-2 spike (S). Это взаимодействие очень похоже на механизм заражения SARS-CoV, возбудителя SARS. Однако для сравнения, взаимодействие субъединицы S1 SARS-CoV-2 с растворимым ACE2 сильнее, чем у SARS-CoV.

<img alt=" Исследование: взаимодействие между спайк-белком SARS-CoV-2 и рецептором вируса человека ACE2 с использованием двухцветной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии. Изображение предоставлено: Андрей Водолажский / Shutterstock "height =" 800 "src =" https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2021/11/shutterstock_1969975771.jpg "title =" Исследование: взаимодействие между Spike Protein SARS-CoV-2 и рецептор вируса человека ACE2 с использованием двухцветной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии. Изображение предоставлено: Андрей Водолажский / Shutterstock "width =" 1200 "/> ] Исследование: Взаимодействие между спайковым белком SARS-CoV-2 и рецептором вируса человека ACE2 с использованием двухцветной флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии. Изображение предоставлено: Андрей Водолажский / Shutterstock

Все вакцины и химические препараты, которые могут продуцировать нейтрализующие антитела для ингибирования этого взаимодействия, могут быть ключевыми терапевтическими кандидатами для лечения коронавирусной болезни 2019 (COVID-19).

Использование флуоресцентной спектроскопии для изучения взаимодействия спайк-ACE2

В исследовании, опубликованном в Журнале Applied Sciences группа исследователей использовала передовую двухцветную флуоресцентную кросс-корреляционную спектроскопию (FCCS), чтобы продемонстрировать взаимодействие между человеческим ACE2 и субъединица S1 SARS-CoV-2 и SARS-CoV. Белки S состоят из двух субъединиц S1 и S2, но в этом исследовании для скрининга ингибиторов использовалась только субъединица S1.

Клетки нейробластомы мыши Neuro2a (N2a) были выбраны в качестве линии клеток для экспрессии белка, ассоциированного с SARS-CoV, поскольку эти клетки демонстрируют высокую экспрессию белка из-за их высокой эффективности трансфекции плазмидной ДНК. Белки ACE2, S1 и S2 очищали и концентрировали из лизатов. Субъединицы hACE2, S1 и S1-2 были помечены флуоресцентными белками в клетках N2a и наблюдались внутри субклеточных компартментов, включая эндоплазматический ретикулум (ER). Результаты показывают, что ACE2, S1 и S1-2 хорошо экспрессируются и локализуются во многих секреторных путях, включая лизосомы и ER.

Результаты показывают, что FCCS количественно определяет взаимодействие между спайковым белком SARS-CoV-2 и человеческим рецептором ACE2 в растворе независимо от анализов на основе твердой и жидкой фазы. Стоит отметить, что взаимодействие белка S SARS-CoV-2 имеет более высокую константу диссоциации (Kd), чем SARS-CoV, на что указывает анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Измеренные амплитуды нормированных функций взаимной корреляции (nCCF) были положительными при анализе смеси между ACE2 и S1 или S1-2. Амплитуда между ACE2 и S1-2 была выше по сравнению с амплитудой между ACE2 и S1. На взаимодействие двухцветных флуорофоров указывают положительные амплитуды nCCF.

Затем исследователи рассчитали относительную амплитуду взаимной корреляции (RCA), чтобы количественно сравнить силы взаимодействия ACE2, S1 и S1-2. RCA – это отношение количества взаимодействующих молекул к общему количеству зеленых флуоресцентных молекул. RCA смеси ACE2 и S1 и S1-2 были значимо положительными. RCA был выше для S1-2, чем для S1, что указывает на то, что, хотя и S1, и S1-2 взаимодействуют с ACE2, взаимодействия S1-2 сильнее, чем взаимодействия S1.

В этом исследовании исследователи провели аффинную очистку полигистидиновой метки, но не смогли получить высокоочищенные образцы. Это не повлияло на результаты исследования, поскольку метод FCCS выявляет взаимодействие белков и специально анализирует целевые молекулярные взаимодействия даже в присутствии нефлуоресцентных примесей. Таким образом, значения количества на молекулу (CPM) белков с флуоресцентной меткой не отличались от таковых для их мономеров, что позволяет предположить, что ACE2, S1 и S1-2 находились в смеси в их мономерных формах. Значения CPM не показали олигомеризации белков, что предполагает взаимно однозначное взаимодействие между ACE2 и субъединицей S1. Стоит отметить, что значения CPM указывают на среднюю яркость отдельной молекулы.

Результаты показывают, что FCCS – мощный инструмент для измерения взаимодействия Spike-ACE2

В исследовании выполнялись два важных условия для анализа FCS, поскольку в нем использовались специально помеченные флуоресцентные метки и изучалась экспрессия интактной формы анализируемого белка. Прежде чем приступить к измерениям FCCS, исследователи подтвердили, что белки в образцах существуют в таком состоянии, с помощью метода вестерн-блоттинга. Вестерн-блоттинг также не выявил доминантных фрагментов флуоресцентных белков, что свидетельствует о том, что лизосомная локализация не приводит к деградации экстрагированных белков. Более того, из-за своей более низкой кислотной стабильности, hACE2, меченный флуоресцентным белком, не обнаруживался в лизосомах.

В заключение, это исследование устанавливает метод анализа взаимодействия между ACE2 и субъединицей S1 шипового белка SARS-CoV-2. Результаты демонстрируют, что FCCS является мощным инструментом для количественного измерения этого взаимодействия, и предполагают, что высокая специфичность FCCS позволяет анализировать взаимодействие даже с белками, которые не являются высокоочищенными.

Учитывая текущую острую необходимость в обнаружении эффективных терапевтических кандидатов от COVID-19, включая перепрофилирование существующих лекарств от других заболеваний, эта основанная на FCCS система обнаружения взаимодействий дает возможность ускорить открытие ингибирующих лекарств SARS-CoV-2.