Геном коронавируса 2 SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома кодирует несколько неструктурных белков (NSP), участвующих в репликации и размножении вируса, при этом известно, что NSP13 играет роль в раскручивании РНК и последующей транскрипции одного многожильный шаблон.

<img alt=" Исследование: различное ингибирование скорости раскручивания ДНК, катализируемое геликазой SARS-Cov-2 (COV19) nsp13 структурно отличными единичными повреждениями ДНК. Изображение предоставлено: Limbitech / Shutterstock "height =" 800 "src = "https://d2jx2rerrg6sh3.cloudfront.net/image-handler/picture/2021/10/shutterstock_1786900304.jpg" title = "Исследование: переменное ингибирование скорости раскрутки ДНК, катализируемое геликазой SARS-Cov-2 (COV19) nsp13 структурно отличными одиночными повреждениями ДНК. Изображение предоставлено: Limbitech / Shutterstock "width =" 1200 "/> ] Исследование: различное ингибирование скорости раскручивания ДНК, катализируемое геликазой SARS-Cov-2 (COV19) nsp13 структурно различными единичными повреждениями ДНК. Изображение предоставлено Limbitech / Shutterstock

Геликаза NSP13 может быть ингибирована путем предотвращения взаимодействия с ДНК-мишенью. В статье, недавно загруженной на сервер препринтов bioRxiv *, исследуется влияние конкретных повреждений ДНК на раскручивающую активность NSP13.

Как проводилось исследование?

3’-конец олигонуклеотидного субстрата метили гасителем флуоресценции, а 5’-конец противоположной цепи метили флуорофором. Следовательно, интенсивность флуоресценции была прямо пропорциональна активности применяемой геликазы NSP13, при которой диссоциация олигонуклеотида прекращает гашение флуорофора.

Специфические повреждения ДНК были созданы на олигонуклеотидном субстрате и впоследствии идентифицированы и разделены с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Под воздействием ультрафиолетового излучения были вызваны два исследованных типа повреждений: сшитые циклобутан-пиримидин-тимин димер (CPD) и повреждения фотопродукта пиримидина (6-4) пиримидона (6-4PP), а еще два были гуаниновыми аддуктами, которые продуцировали либо ] транс или цис стереоизомеры.

Что обнаружило исследование?

Было замечено, что все четыре типа повреждения ДНК вызывают серьезную потерю активности раскручивания NSP13, причем скорость раскручивания оказывается в 20-100 раз медленнее, чем у немодифицированной ДНК. В немодифицированной ДНК первоначальный всплеск активности раскручивания происходит из-за быстрого раскручивания ранее существовавших дуплексов NSP13-ДНК, который замедляется, поскольку последующее комплексообразование становится ограничивающим фактором. Подобная взрывная активность не наблюдалась для поражений, несущих ДНК. Таким образом, группа затем исследовала, предотвращают ли поражения комплекс NSP13-ДНК или только его последующую активность.

Транс ДНК характеризуется спариванием интактных оснований и почти нормальной основной цепью, в то время как цис ДНК значительно более искажена вокруг участка поражения. В результате NSP13 мог лучше взаимодействовать с транс ДНК, и наблюдалась значительно большая раскручивающая активность. NSP13 образует узкий канал, через который должна проходить перемещающаяся нить, и было обнаружено, что дополнительные стерические препятствия, создаваемые цис ДНК, замедляют скорость раскручивания. Точно так же ДНК, несущая менее объемные поражения CPD и 6-4PP, раскручивалась в 2-5 раз быстрее, чем цис или транс поражение.

Поражение CPD имеет две поперечно сшитые ковалентные связи, в то время как 6-4PP несет только одну, но в целом более искажает основу ДНК. Опять же, это напрямую выражается в более медленной скорости раскручивания NSP13 для ДНК, несущей поражение 6-4PP, чем CPD.

Авторы отмечают, что способ раскручивания ДНК, несущей либо менее объемный CPD, либо 6-4PP, либо более крупные аддукты гуанина, отличается не только по скорости, но и по характеру, причем скорость меняется со временем. ДНК, несущая повреждения CPD или 6-4PP, разматывалась NSP13 нелинейным образом до тех пор, пока выходы не составляли 25-35%, после чего скорость разматывания выходила на плато. Наоборот, скорость раскручивания увеличивалась более медленно и линейно с течением времени для ДНК, несущей цис или транс гуаниновые аддукты, по крайней мере, до 35% и потенциально выше.

* Важное примечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, руководящие в клинической практике / поведении, связанном со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.