Инструменты на основе CRISPR произвели революцию в нашей способности нацеливаться на связанные с болезнью генетические мутации. Технология CRISPR включает растущее семейство инструментов, которые могут манипулировать генами и их экспрессией, в том числе путем воздействия на ДНК ферментами Cas9 и Cas12 и воздействия на РНК ферментом Cas13. Эта коллекция предлагает различные стратегии для решения мутаций. Ориентация на связанные с болезнью мутации в РНК, которая является относительно короткой, позволит избежать постоянных изменений в геноме. Кроме того, некоторые типы клеток, такие как нейроны, трудно редактировать с помощью CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования, и необходимы новые стратегии для лечения разрушительных заболеваний, поражающих мозг.

Исследователь Института МакГоверна и Институт Бродовского университета, основной член Гарвардского университета Фэн Чжан и его команда в настоящее время разработали одну такую ​​стратегию под названием RESCUE (Редактирование РНК для специфического обмена C на U), описанную в журнале Science ].

Чжан и его команда, включая первых соавторов Омара Абудайе и Джонатана Гутенберга (оба в настоящее время являются сотрудниками McGovern), использовали деактивированный Cas13, чтобы направлять RESCUE к целевым цитозиновым основаниям на транскриптах РНК, и использовали новый, усовершенствованный, программируемый фермент, превращающий нежелательный цитозин в уридин – тем самым направляя изменение в инструкциях РНК. RESCUE основывается на REPAIR, технологии, разработанной командой Чжана, которая превращает адениновые основания в инозин в РНК.

RESCUE значительно расширяет ландшафт, на который могут ориентироваться инструменты CRISPR, чтобы включать модифицируемые позиции в белках, такие как сайты фосфорилирования. Такие сайты действуют как переключатели включения / выключения белковой активности и особенно обнаруживаются в сигнальных молекулах и связанных с раком путях.

Для лечения разнообразия генетических изменений, вызывающих болезни, нам нужен набор точных технологий на выбор. Разработав этот новый фермент и объединив его с программируемостью и точностью CRISPR, мы смогли заполнить критический пробел в наборе инструментов ».

Чжан, профессор нейробиологии им. Джеймса и Патрисии Пойтрас в Массачусетском технологическом институте

У Чжана также есть назначения в отделах мозга и когнитивных наук и биологической инженерии Массачусетского технологического института.

Расширение охвата редактирования РНК до новых целей

Ранее разработанная платформа REPAIR использовала РНК-таргетинг CRISPR / Cas13 для направления активного домена редактора РНК, ADAR2, на специфические РНК-транскрипты, где он мог бы конвертировать нуклеотидное основание аденин в инозин, или буквы А в И. Чжан и его коллеги взяли сплав REPAIR и развивали его в лаборатории, пока он не сменил цитозин на уридин или С на U.

RESCUE можно направить к любой выбранной РНК, а затем выполнить редактирование C-to-U через усовершенствованный компонент ADAR2 платформы. Команда внедрила новую платформу в клетки человека, показав, что они могут нацеливаться на природные РНК в клетке, а также на 24 клинически значимых мутации в синтетических РНК. Затем они дополнительно оптимизировали RESCUE, чтобы уменьшить нецелевое редактирование, в то же время минимально нарушая целевое редактирование.

Новые цели в поле зрения

Расширенное нацеливание RESCUE означает, что сайты, регулирующие активность и функцию многих белков посредством посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование, гликозилирование и метилирование, теперь могут быть более легко нацелены на редактирование.

Основным преимуществом редактирования РНК является ее обратимость, в отличие от изменений, сделанных на уровне ДНК, которые являются постоянными. Таким образом, RESCUE может быть развернуто временно в ситуациях, когда модификация может быть желательной временно, но не навсегда. Чтобы продемонстрировать это, команда показала, что в клетках человека RESCUE может нацеливаться на специфические сайты в РНК, кодирующей β-катенин, которые, как известно, фосфорилированы на белковом продукте, что приводит к временному увеличению активации β-катенина и росту клеток. Если бы такое изменение было сделано навсегда, это могло бы предрасполагать клетки к неконтролируемому росту клеток и раку, но с помощью RESCUE временный рост клеток мог потенциально стимулировать заживление ран в ответ на острые повреждения.

Исследователи также нацелены на патогенный вариант гена, APOE4. Аллель APOE4 постоянно выступает в качестве генетического фактора риска развития болезни Альцгеймера с поздним началом. Изоформа APOE4 отличается от APOE2, которая не является фактором риска, всего двумя различиями (оба C в APOE4 против U в APOE2). Чжан и его коллеги внедрили связанную с риском РНК APOE4 в клетки и показали, что RESCUE может преобразовывать свои сигнатуры C в последовательность APOE2, по существу, преобразовывая риск в вариант без риска.

Чтобы облегчить дополнительную работу, которая подтолкнет RESCUE к клинике, а также даст возможность исследователям использовать RESCUE в качестве инструмента для лучшего понимания вызывающих болезнь мутаций, лаборатория Чжана планирует широко использовать систему RESCUE, как это было с ранее разработанными Инструменты CRISPR. Технология будет свободно доступна для академических исследований через некоммерческое хранилище плазмид Addgene. Дополнительную информацию можно найти на веб-странице лаборатории Чжана.