Моноклональные антитела имеют множество применений – они могут лечить вирусные заболевания, такие как коронавирусная болезнь 2019 (COVID-19), использоваться в диагностических тестах, таких как тесты бокового кровотока, для выявления наличия заболевания или его прошлых случаев, и обычно используются для различных исследовательских целей. Обычно антитела создаются путем иммунизации животного желаемой мишенью и сбора антител из их сывороток.

Однако это не быстро, надежно и не всегда функционально – тем более, что все больше и больше исследователей обращаются к продуктам, не содержащим животных. К сожалению, создание антител in vitro традиционно было менее эффективным, поскольку антитела проявляли более низкую функциональность. Исследователи из Института Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда, стремящиеся решить эту проблему, создали платформу бесклеточной инженерии нанотел, которая может эффективно и быстро производить антитела.

Выводы группы можно найти в журнале Nature Communications .

Связывание антител с антигенами определяется вариабельными доменами тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL / VK). Однако некоторые верблюдовые вырабатывают антитела без легкой цепи, которые связываются с антителами за счет использования уникального домена VHH. Они известны как нанотела, и, поскольку они малы и стабильны при температуре до 90 ° C, они имеют огромные перспективы для использования в будущем.

Хотя библиотеки нанотел используются эффективно, низкая эффективность трансформации делает их громоздкими для использования в клетках. Бесклеточные подходы позволяют избежать этой проблемы, делая библиотеки нанотел первоклассными кандидатами как для исследователей, так и для медицинских работников и производственных компаний.

Платформа, известная как бесклеточная идентификация VHH с использованием кластерного анализа, или сокращенно CeVICA, включает в себя библиотеку синтетических нанотел, отображение рибосом и метод расчета расчетного связывания. В качестве одной из первых проверок его возможностей ученые попытались создать нанотела, нацеленные на рецептор-связывающий домен (RBD) шипового белка коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2).

Спайковый белок особенно важен для SARS-CoV-2 и ответственен за большую часть патогенности вируса. RBD субъединицы S1 связывается с ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ACE2), обеспечивая проникновение вируса в клетку, в то время как N-концевой домен отвечает за слияние мембран. Нацеливание на RBD особенно ценно, поскольку оно не только позволяет иммунной системе идентифицировать SARS-CoV-2, но также помогает предотвратить проникновение вируса в клетки.

Во-первых, исследователи разработали библиотеки нанотел, содержащие случайные области, определяющие комплементарность (CDR), для использования в качестве входных данных для платформы. Чтобы разработать это, они проанализировали характеристики последовательности почти 300 уникальных нанотел. После идентификации четырех рамок, демонстрирующих высокую гомологию с генами вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека (IGHV), они использовали консенсусные последовательности, извлеченные из них, для создания окончательных ДНК-матриц нанотел, включая дополнительные рамки на основе хорошо охарактеризованных нанотел. Эту смесь можно использовать в качестве матриц для реакций ПЦР, а случайность может быть индуцирована с помощью 5'-последовательности NNB. Нуклеотиды ДНК шпильки использовали для блокирования лигирования одного конца продукта ПЦР. CDR длиной более 13 аминокислот встречаются редко, поэтому не были включены. После рандомизации всех положений CDR и отбора антител к Myc платформа смогла создать 27,5% полноразмерных последовательностей и 3,68 × 10 11 полноразмерных последовательностей на мкг библиотечной ДНК.

Всего было идентифицировано 862 скопления. Чтобы определить, какие из них являются истинными связывающими веществами / нейтрализаторами, 24 репрезентативных образца из них были клонированы и очищены, а затем их эффективность против шипового белка SARS-CoV-2 была оценена с помощью ELISA и нейтрализации псевдовируса. Девятнадцать из этих образцов показали положительные результаты ELISA, указывающие на сильную связывающую способность, а другие 5 показали 20% ингибирование по меньшей мере одного варианта RBD. Один образец, SR38, показал более сильное ингибирование нескольких псевдовирусов, чем ранее протестированные нанотела животного происхождения. После дальнейшего тестирования 30/38 нанотел показали положительное связывание, что свидетельствует о высокой производительности этой платформы. Благодаря большему созреванию аффинности эти нанотела можно усовершенствовать еще больше.

Авторы подчеркивают перспективность их бесклеточной платформы для быстрого создания эффективных нанотел против новых мишеней. Поскольку европейские правила затрудняют получение антител от животных, а ученые продолжают предупреждать о будущих пандемиях, это очень ценный инструмент для борьбы с болезнями. Повышенная термическая стабильность может позволить препаратам на основе нанотел распространяться дальше с меньшими затратами в более изолированные районы.

Больше, чем просто стабильность, было даже свидетельство точной повторной укладки после полной термической денатурации. По мере дальнейшей автоматизации этой технологии она может стать стандартом для быстрого масштабируемого производства антител – крайне необходимого прогресса.