Ученые из Института Фрэнсиса Крика разработали всеобъемлющую базу данных о генной активности у мышей на десяти моделях заболеваний, которая может значительно сократить использование животных во всем мире, которая дает полную картину иммунного ответа на различные патогены.

Данные, опубликованные в Nature Communications и доступные через онлайн-приложение, показывают активность каждого гена мыши – более 45 000 генов – в крови мышей с десятью различными заболеваниями. Для шести заболеваний, связанных с легкими, были также исследованы образцы из легких.

Ранее исследователям приходилось создавать, заражать, отбирать, получать образцы от мышей, а также извлекать и секвенировать РНК для изучения интересующих их генов. Используя новое приложение, которое лаборатория создала для этого исследования, исследователи смогут проверить активность любого гена по ряду заболеваний, не нуждаясь в собственных мышах. Это может предотвратить использование тысяч мышей в отдельных экспериментах.

Исследовательская группа, возглавляемая лидером группы Crick Энн О'Гарра и координируемая Кристин Грэм, работала со многими сотрудниками из Crick, Великобритании и США. Они использовали технологию секвенирования следующего поколения, «RNA-seq», для измерения активности генов при различных заболеваниях. Поскольку гены должны транскрибировать свою ДНК в РНК, чтобы функционировать, анализ РНК показывает, насколько активен каждый ген – в данном случае после заражения или заражения аллергеном.

Активность генов может показать нам, как организм реагирует на инфекции и аллергены. Тысячи генов участвуют в любом иммунном ответе, поэтому Акул Сингхания, Постдоктор биоинформатики, в нашей лаборатории использовал передовые биоинформатические подходы для кластеризации генов в модули. Эти модули представляют кластеры генов, которые совместно регулируются и часто могут быть аннотированы для определения их функции и известных физиологических ролей. Например, из 38 модулей легкого существует модуль, связанный с аллергией, который встречается только в модели аллергии, содержащей более 100 генов, и другой модуль, связанный с Т-клетками, содержащий более 200 генов.

Секвенируя легочную ткань и кровь, мы также можем видеть, как иммунный ответ в крови отражает местный ответ в легком, и наоборот. Это поможет нам понять, что мы можем узнать из генетических сигнатур в крови, поскольку при большинстве заболеваний врачи не могут реально получить образцы легких у пациентов ».

Энн О'Гарра, руководитель группы Крик

Множество патогенов

С помощью нового приложения исследователи в любой точке мира могут искать активность генов в легких и крови мышей, зараженных целым рядом патогенов: паразитом Toxoplasma gondii, вирусом гриппа и респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), бактерией Burkholderia pseudomallei, грибок Candida albicans или аллерген, клещ домашней пыли. Они также могут видеть активность генов в крови мышей с листериями, мышиным цитомегаловирусом, малярийным паразитом Plasmodium chabaudi chabaudi или хронической инфекцией Burkholderia pseudomallei.

В ходе исследования исследовательская группа проанализировала генетические признаки, связанные с этими заболеваниями, чтобы помочь понять иммунный ответ. Они обнаружили широкий спектр иммунных ответов в легких, где в дискретных модулях преобладали гены, связанные с интерферонами типа I или типа II, IL-17 или реакциями аллергического типа. Известно, что интерфероны типа I высвобождаются в ответ на вирусы, тогда как интерферон типа II (IFN-?) Активирует фагоциты для уничтожения внутриклеточных патогенов, а IL-17 привлекает нейтрофилы, вызывая ранние воспалительные иммунные реакции. Интересно, что сигнатуры гена интерферона присутствовали в модулях крови подобно легкому, но реакции на IL-17 и аллергию не было.

Удивительно, но гены, связанные с интерфероном типа I, были очень активными как в легких, так и в крови мышей, инфицированных паразитом Toxoplasma gondii, а также наблюдались в ответ на бактерию Burkholderia pseudomallei, хотя и в меньшей степени. Это ставит под сомнение мнение о том, что гены, ассоциированные с интерфероном I типа, обязательно указывают на вирусные инфекции, как ранее было показано в лаборатории по туберкулезу.

«Мы обнаружили, что мыши без функционирующих интерфероновых путей были в меньшей степени способны бороться с токсоплазменной инфекцией. Это было верно как для интерферонов типа I, так и для типа II, которые имеют сложные отношения друг с другом. Мы обнаружили, что обе играют ключевую роль в защите от паразита, частично путем контроля нейтрофилов в крови, которые в больших количествах могут нанести вред хозяину ".

От морального старения к возможностям

Исследовательский проект начался в 2009 году с использованием метода, известного как микроматрица, для определения активности генов в образцах легких и крови, и был почти завершен и готов к анализу к 2015 году. Микрочип был тогда хорошо отработанным методом, но необходимыми реагентами. были неожиданно сняты с производства до обработки окончательных образцов. Без оборудования для завершения последовательности, проект был в беде.

С этой технологией микрочипов, команде больше не нужен подход. В это время на рынке появилась методика под названием RNA-Seq, предлагающая лучший способ количественной оценки активности генов.

После переговоров между Энн и производителем ее команде бесплатно предложили новейшие реагенты RNA-Seq для обработки образцов, начиная с конца 2016 года. Им также было предоставлено место для хранения огромных объемов сгенерированных данных.

Поскольку образцы тканей и крови из экспериментов с микрочипами были заморожены при хранении, Кристина Грэм в лаборатории Анны смогла вернуться к тем же образцам и снова героически обработать их, на этот раз для секвенирования РНК. Благодаря отличному хранению образцов это стало возможным без использования дополнительных животных. Несмотря на то, что Кристина отнимала много времени и требовала огромных усилий, к 2018 году команда получила все необходимые данные о последовательности.

Акул Сингхания решил обработать огромное количество данных. Используя передовые методы биоинформатики, он сгруппировал тысячи генов и миллионы точек данных в осмысленную и визуальную форму, которую мы называем модулями, и создал приложение, чтобы сделать данные доступными для всех.

«Через десять лет с начала проекта у нас теперь есть ресурс открытого доступа к экспрессии генов, который любой человек в мире может использовать для поиска своих любимых генов, а также для того, чтобы узнать, регулируются ли они передачей сигналов интерферона типа I или типа II, "говорит Энн. «Никто не говорил, что наука легка, но она, безусловно, стоит».